Передача манипулируемых опухолевых нейтрофилов в опухолевых мышей для изучения их ангиогенного потенциала в Vivo
Summary
Здесь мы показываем терапевтический потенциал антиангиогенных опухолевых нейтрофилов после их передачи в опухолевых мышей. Этот протокол может быть использован для манипулирования активностью нейтрофилов ex vivo и для последующей оценки их функциональности in vivo при разработке опухолей. Это подходящая модель для изучения потенциальных иммунотерапии на основе нейтрофилов.
Abstract
Вклад нейтрофилов в регуляцию опухолевого генеза становится все более внимания. Эти клетки неоднородны, и в зависимости от среды опухоли может обладать про- или противоопухолевой способности. Одним из важных цитокинов, регулирующих функции нейтрофилов в опухолевом контексте, являются интерфероны i типа. При наличии интерферонов нейтрофилы приобретают противоопухолевые свойства, в том числе цитотоксичность или стимуляцию иммунной системы. И наоборот, отсутствие интерферона сигнализации приводит к заметной проопухолевой активности, характеризующейся сильной стимуляцией опухолевого ангиогенеза. Недавно мы могли бы продемонстрировать, что проангиогенные свойства нейтрофилов зависят от активации никотинамидаф фосфорибозилтрансферазы (NAMPT) сигнальный путь в этих клетках. Ингибирование этого пути у опухолевых нейтрофилов приводит к их мощному антиангиогенного фенотипу. Здесь мы демонстрируем нашу недавно созданную модель, позволяющую in vivo оценивать опухолевый потенциал манипулируемых опухолевых нейтрофилов (TANs). Вскоре, про-ангиогенных опухолевых опухолей связанных нейтрофилов могут быть изолированы от опухолевых интерферон-дефицит мышей и повторно поляризованы в анти-ангиогенный фенотип путем блокирования NAMPT сигнализации. Ангиогенная активность этих клеток может быть впоследствии оценена с помощью аортического кольца. Антиангиогенные TANs могут быть переданы в опухолевых диких получателей типа и рост опухоли должны контролироваться в течение 14 дней. На день 14 мышей приносятся в жертву, опухоли удаляются и разрезаются с их васкуляризацией. В целом, наш протокол предоставляет новый инструмент для in vivo оценки ангиогенной способности первичных клеток, таких как опухолевые нейтрофилы, без необходимости использования искусственных моделей линии нейтрофилов. Vc
Introduction
Интерфероны типа I (IFNs) играют важную роль в стимуляции реакции хозяев на неоплазию, так какотсутствие сигнализации типа I IFN приводит к значительно повышенному росту опухоли 1. Одним из механизмов, участвующих в этом процессе является регуляция опухолевой активности опухолевых нейтрофилов, которая контролируется колони-стимулирующим фактором 3-го рецептора (CSF3R) вниз по течению сигнализации2. Колония-стимулирующий фактор 3 (CSF3), или гранулоцит колонии стимулирующий фактор, было показано, чтобы активировать сигнализации с участием никотинамида фосфорибозилтрансферазы (NAMPT)3,4. NAMPT является ограничение скорости ферментдля никотинамидад аденин динуклеотид синтез, который повышает гликолиза и регулирует ремонт ДНК, экспрессия генов, и стресс ответ содействия выживанию раковых клеток и пролиферации5. NAMPT является overexpressed в нескольких типах рака, в том числе колоректального, яичников, молочной железы, желудка, рака предстательной железы и глиомы6. NAMPT имеет важное значение не только для опухолевых клеток, но и для широкого спектра других типов клеток, которые присутствуют в опухолях, таких как миелоидные клетки – это диски их дифференциации4, ингибирует апоптоз и стимулирует выражение нескольких цитокинов или матричных деградирующих ферментов у макрофагов7.
Связанные с опухолями нейтрофилы представляют собой важные модуляторы роста опухоли. Функции TAN сильно зависят от типа I IFN доступности, так как эти цитокины премьер противоопухолевой активности нейтрофилов. Напротив, отсутствие IFNs поддерживает опухолевую активацию этих клеток, особенно их проангиогенные свойства. В согласии с этим, мыши, дефицит которых в IFNs развиваются значительно больше и лучше васкуляризированных опухолей, которые сильно проникли с про-опухолевых / про-ангиогенных нейтрофилов1,2,8, 9,10. Важно отметить, что такие проангиогенные TANs показывают повышенную активность NAMPT, предлагая свою существенную роль в про-опухолевой поляризации нейтрофилов.
Истощение нейтрофилов с использованием антител Ly6G или ингибирование их миграции (CXCR2 антитела) приводит к снижению ангиогенеза опухоли, роста и метастазов1,8. Тем не менее, генерируемые моноклональные антитела иммуногенны, а их введение связано с целым рядом опасных для жизни побочных эффектов11. Лечение с помощью небольших молекул, таких как ингибитор NAMPT FK866, который модулирует нейтрофил опухолевого генетики, может помочь избежать таких осложнений. К сожалению, фармакологическое системное ингибирование NAMPT, рядом с его терапевтическим воздействием на рост опухоли, приводит к тяжелым побочным эффектам, включая желудочно-кишечную токсичность и тромбоцитопению. Таким образом, системное применение ингибиторов NAMPT не представляется возможным12,13,14.
По этой причине мы предлагаем здесь протокол, в котором деятельность NAMPT блокируется непосредственно в изолированных TANs. Такие противоопухолевые нейтрофилы затем приемные передаются в опухолевый хозяин. Этот протокол поможет избежать системных токсических побочных эффектов соединений, в то время как его влияние на клетки-мишени будет устойчивым.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на прогресс в хирургическом и фармакологическом лечении рака, успешная терапия остается проблемой. Поскольку иммунные клетки, как известно, играют важную роль в регуляции роста опухоли, новые методы, ингибирующие опухолевость таких клеток должны быть установлены. Здесь мы де?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Наша работа была поддержана грантами от Deutsche Krebshilfe, Грант номер: 111647, и Немецкий научно-исследовательский совет (DFG), Номер гранта: JA 2461»2-1.
Materials
| 15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
| 50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
| 6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
| 96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| 96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
| AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
| anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
| BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
| Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
| Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
| Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
| Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
| Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
| DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
| DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
| DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
| Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
| Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
| FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
| IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
| Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
| Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
| Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
| Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
| Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
| rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
| StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
| Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
| Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
| Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
| T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
Referencias
- Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
- Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
- Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
- Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).
- Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
- Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
- Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
- Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
- Wu, C. -. F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
- Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
- Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Investigación sobre el cáncer. 63, 7436-7442 (2003).
- Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
- von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
- De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
- Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).
