Eine neuartige Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Korrekturmethode zur intrazellulären Ca2+-Messung mit Fura-2-Analog in lebenden Zellen
Summary
Aufgrund der spektralen Überlappung der Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH- und Fura-2-Analogen ist die Signalinterferenz beider Chemikalien in lebenden Zellen bei der quantitativen Messung von [Ca2+ ]unvermeidbar. So wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt.
Abstract
Zur quantitativ [Ca2+] werden häufig Fura-2-Analoga verwendet, die ratiometrische Fluorosonden sind. Allerdings ist die Verwendung von Farbstoffen in lebenden Zellen aufgrund von Autofluoreszenzstörungen, hauptsächlich durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), an sich beschränkt. Genauer gesagt ist dies ein großes Hindernis bei der Messung der mitochondrialen [Ca2+] quantitativ mit Fura-2 Analoga, da die Mehrheit der NADH in den Mitochondrien ist. Wenn die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration gleich ist, sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Basierend auf diesem Prinzip wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt, und die tatsächliche Signalintensität von NADH und Fura-2 kann erreicht werden. Darüber hinaus wurde eine neuartige Gleichung zur Berechnung [Ca2+] mit isosbestischer Anregung oder Anregung bei 400 nm entwickelt. Mit dieser Methode konnten Veränderungen in mitochondrialen [Ca2+] erfolgreich gemessen werden. Darüber hinaus konnten bei einem anderen Satz der Anregungs- und Emissionswellenlängen mehrere Parameter, einschließlich NADH, [Ca2+], und pH- oder mitochondriales Membranpotential(m) gleichzeitig gemessen werden. Mitochondrial [Ca2+] undm oder pH wurden mit Fura-2-FF und Tetramethylrhodinethylester (TMRE) oder Carboxy-Seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1) gemessen.
Introduction
Die bedeutende Rolle der intrazellulären Ca2+ ist weithin bekannt1. Die Quantifizierung von [Ca2+] ist wesentlich, um die Prozesse der zellulären physiologischen Funktionen zu verstehen. Fura-2-Analoga sind sehr nützlich, da sie im UV-Bereich (<400 nm) angeregt werden und die ratiometrische Methode für die quantitative Messung angewendet werden kann. Daher können andere physiologische Parameter wie pH,H,H., Membranpotenzial usw. mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen gemessen werden. Die mitochondriale Ca2+-Konzentration ([Ca2+]m) lag den Angaben zufolge bei 0,08 x 20 ,2,3,4,5. Unter fura-2 Analoga eignet sich fura-2-FF zur Messung dieses Bereichs von [Ca2+]. Allerdings enthalten die lebenden Zellen leider NADH/NADPH für ihre Stoffwechselprozesse, und NADH erzeugt Signalstörungen aufgrund der überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren mit dem fura-2 Analog. Diese Interferenz schränkt die Verwendung von fura-2 Analogen stark ein. Insbesondere, wenn das Analoge angewendet wird, um mitochondrial [Ca2+] zu messen, ist diese Interferenz das größte Hindernis, da die höchste Menge an NADH in den Mitochondrien liegt. Erschwert wird dies noch durch NADH-Änderungen im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Membranpotential(m) und die Veränderung vonm wirkt sich auf [Ca2+]m6,7,8 , 9. Darüber hinaus ist es für das Studium der Dynamik [Ca2+]m wichtig, den Status anderer mitochondrialer Parameter, wie NADH,mund pH, zu kennen.
Die Emissionen bei 450 nm und 500 nm mit Anregungen bei 353 nm, 361 nm und 400 nm enthalten die Signale von NADH und fura-2-FF, und die Gleichungen sind wie folgt. Hierin sind 353 nm bzw. 361 nm die isosbestischen Punkte von fura-2-FF für Emissionen bei 450 nm bzw. 500 nm.
F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Gleichung 1
F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Gleichung 2
F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Gleichung 3
wobei Fx,y die gemessene Emissionsintensität bei y-nm durch x-nm Anregung, Fx,y,NADH die reine NADH-abhängige Emissionsintensität und Fx,y,Fura die reine fura-2-FF-abhängige Emissionsintensität darstellt. Bei gleicher Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Ca2+ und Fura-2 hatten keinen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften von NADH; Daher war das Verhältnis der Emission bei 450 nm und bei 500 nm NADH bei jeder Anregungswellenlänge konstant. Die gleiche Regel kann für fura-2-FF verwendet werden, basierend auf der Annahme, dass NADH oder [Ca2+] die Emissions- und Anregungsspektren von fura-2-FF nicht beeinflusst. Ca2+ verursachte jedoch eine spektrale Verschiebung der Fura-2-FF-Emission. Daher muss verwendet werden, um die Wirkung von Ca2+zu entfernen, isosbestische Anregung, die unabhängig von Ca2+ist. Jede Emissionswellenlänge (d.h. 450 nm und 500 nm) hat einen anderen isosbestischen Punkt, und aus unserem Versuchsaufbau wurden 353 nm bei 500 nm und 361 nm bei 450 nm gewählt. Daraus sind die folgenden Gleichungengültig 10.
Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Gleichung 4
RN1 = F400.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 5
RN2 = F353.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 6
Bei diesen Konstanten sind die folgenden Gleichungen aus (Gleichung 1) (Gleichung 2) und (Gleichung 3) gültig.
F361.450 = F361.450,NADH + Rf n F353.500,Fura Gleichung 7
F353.450 = RN2 x F361.450,NADH + F353.500,Fura Gleichung 8
F400.500 = RN1 x F361.450,NADH + F400.500,Fura Gleichung 9
Aus diesen Gleichungen können, wenn Rf, RN1und RN2 bekannt sind, reine Signale von NADH und Fura-2 wie folgt erhalten werden.
F361.450,NADH = (F361.450 – Ff – F353.500)/(1 x Rf – RN2) Gleichung 10
F353.500,Fura = (RN2 x F361.450 – F353.500)/(Rf – RN2 – 1) Gleichung 11
F400.500,Fura = F400.500 – RN1 – F361.450,NADH Gleichung 12
RFura = F353.500,Fura/F400,500,Fura Gleichung 13
Die Ca2+-gebundene Form von fura-2-FF war bei der 400 nm Erregungswellenlänge praktisch nicht fluoreszierend. Basierend auf dieser Eigenschaft kann die folgende neue Kalibrierungsgleichung abgeleitet werden.
[Ca2+] = Kd (F 400.500,max/F353,500,max)
wobei Kd eine Dissoziationskonstante ist, Sind F400.500,max und F353.500,max sind die Maximalwerte der emittierten Signale bei 500 nm mit Anregungen bei 400 nm bzw. 353nm, und R min ist die minimale RFura in Ca2 +-freier Zustand. Da die isosbestischen Anregungen verwendet wurden, kann die Gleichung wie folgt weiter vereinfacht werden.
[Ca2+] = Kd (1 / Rmin) ( RFura – Rmin) Gleichung 15
Daher sind nur Kd- undR-min-Werte erforderlich, um [Ca2+] zu berechnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Interferenzkorrekturmethode wurde erfolgreich zur Messung der Signale von NADH- und Fura-2-Analogen entwickelt. Eine genaue Messung der Signale ist für die exakte Korrektur unerlässlich. Die inhärente Natur der Fluoreszenzvorrichtung erzeugt jedoch ein Hintergrundsignal, das nichts mit dem von NADH von fura-2 zu tun hat. Der bandpass-Filter höchster Qualität kann nur bis zu 10x 8 der unerwünschten Wellenlängen des Lichts passieren. Das fluoreszierende Signal einer einzelnen Zelle ist jedoch sehr kle…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch das Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2018R1A6A01011832) vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (NRF-2016M3C1A6936606) gefördert wurde. und vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (10068076).
Materials
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
Referencias
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