Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.
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Artículo de método
Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto
En este artículo
Resumen
Resumen
Se cree que la mitad de todas las transcripciones humanas están reguladas por microARN. Por lo tanto, la cuantificación de la expresión de microARN puede revelar mecanismos subyacentes en los estados de la enfermedad y proporcionar dianas terapéuticas y biomarcadores. Aquí, detallamos cómo cuantificar con precisión los microRNAs. Brevemente, este método describe el aislemiento de microARN, ligando a adaptadores adecuados para la secuenciación de alto rendimiento, la amplificación de los productos finales y la preparación de una biblioteca de muestras. A continuación, explicamos cómo alinear las lecturas de secuenciación obtenidas con horquillas microRNA, y cuantificar, normalizar y calcular su expresión diferencial. Versátil y robusto, este flujo de trabajo experimental combinado y análisis bioinformático permite a los usuarios comenzar con la extracción de tejidos y terminar con la cuantificación de microARN.
Introducción
Descubierto por primera vez en 19931, ahora se estima que casi 2000 microARN están presentes en el genoma humano2. Los MicroRNAs son ARN pequeños que no codifican y que suelen tener entre 21 y 24 nucleótidos de largo. Son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica, a menudo uniéndose a sitios complementarios en la región 3 no traducida (3-UTR) de genes diana para reprimir la expresión de proteínas y degradar el ARNm. La cuantificación de los microARN puede proporcionar información valiosa sobre la expresión génica y se han desarrollado varios protocolos para este propósito3.
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Protocolo
Los experimentos con animales fueron autorizados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.
Preparación de la biblioteca de ARN pequeño
1. Aislamiento de ARN
- Aísle el ARN de una fuente biológica utilizando un reactivo de aislamiento de ARN estándar, o un kit que enriquezca para los microARN. Para los tejidos, lo mejor es comenzar con muestras congeladas en nitrógeno líquido y molidas a un polvo utilizando un mortero preenfriado y un pestillo.
- Mida la integridad del ARN de cada muestra en un instrumento que pueda cua....
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Resultados
Esquema de los pasos involucrados en la preparación de la biblioteca
En la Figura 2se describe un esquema general de extracción, secuenciación y alineación de ARN pequeños.
Se recogieron muestras de hígado de un ratón macho y una hembra y se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo y evaluó la calidad y la concentración.
La secuenciación de ARN pequeño .......
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Discusión
A pesar de la identificación de microARN hace más de 20 años13, el proceso de secuenciación de microARN sigue siendo laborioso y requiere equipos especializados, impidiendo a los laboratorios adoptar rutinariamente protocolos internos14. Otras técnicas pueden evaluar simultáneamente los microARN, como microarrays de microARN y paneles de expresión multiplexados; sin embargo, estos enfoques son limitados en el que sólo cuantifican los microRNAs presentes en su conjunto de so.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a los miembros de los laboratorios de Andrew Fire y Mark Kay por su orientación y sugerencias.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escalera de ADN de 100 pb | NEB | N3231 | |
| Bis-acrilamida 19:1 | Millipore Sigma | A9926 | |
| Escalera de tijera de ADN de 25 pb | Promega | G4511 | |
| Fenol/cloroformo ácido | ThermoFisher | AM9720 | |
| Colorante de carga de ARN de acrilamida | ThermoFisher | R0641 | |
| Persulfato de amonio (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Instrumento bioanalizador | Agilent | G2991AA | Para evaluar la calidad y la concentración de ARN |
| Cloroformo | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Etanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Tampón de carga de gel II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | El color azul ayuda a visualizar el pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana Kit de aislamiento de microARN | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | Para generar pequeños datos |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve agarosa de bajo punto de fusión | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (película de sellado de laboratorio) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Polietilenglicol 8000 | NEB | incluido con M0204 | |
| ProtoScript II Kit de síntesis de ADNc de primera cadena | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Kit de extracción | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorómetro | ThermoFisher | Q33226 | Para cuantificar la concentración de ADN |
| Qubit RNA HS Kit de ensayo | ThermoFisher | Q32855 | |
| Cuchillas de afeitar | Fisher Scientific | 12640 | |
| Tubos siliconados de baja retención de 1,5 ml | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligasa 1 | NEB | M0204 | |
| T4 ARN ligasa 2, truncada K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent G2939BA | Para evaluar la calidad y concentración | |
| ARN Taq ADN polimerasa | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| Bromuro de etidio ultrapuro (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Enlazador universal de clonación de miARN | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
Referencias
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., B....
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Reimpresiones y permisos
