프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비
Summary
이 문서에서는 주변 질량 분석법을 기반으로 하는 고유한 실시간 분석 방법에 대한 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 방법을 사용하면 특별한 전처리 없이 생체 내 생물학적 분자를 실시간으로 분석할 수 있습니다.
Abstract
질량 분석법(MS)은 분자량과 구조를 추론하는 데 유용한 질량 대 전하비율(m/z)과같은 분자에 대한 매우 정확한 정보를 제공하기 때문에 분석 화학에서 강력한 도구입니다. 본질적으로 파괴적인 분석 방법이지만, 주변 이온화 기술의 최근 발전으로 인해 조직은 무결성 측면에서 상대적으로 손상되지 않은 상태로 유지하면서 데이터를 수집할 수 있게 되었습니다. 프로브 전기 분무 이온화 (PESI)는 시료의 복잡하고 시간이 많이 소요되는 전처리를 필요로하지 않기 때문에 소위 직접 방법입니다. 미세 바늘은 샘플 피커뿐만 아니라 이온화 방출기역할을합니다. 프로브 팁의 매우 날카롭고 미세한 특성에 따라 샘플의 파괴가 최소화되어 있어 살아있는 생물로부터 실시간 분자 정보를 얻을 수 있습니다. 본 명세서에서는 생물의학 연구 개발에 유용한 PESI-MS 기술의 3가지 적용을 소개합니다. 하나는 의료 진단을위한이 기술의 기본 응용 프로그램인 고체 조직에 대한 응용 프로그램을 포함합니다. 이 기술은 단지 10 mg의 샘플을 필요로하기 때문에, 일상적인 임상 설정에서 매우 유용 할 수 있습니다. 두 번째 응용 프로그램은 인간의 혈액 혈청이 측정되는 체외 의료 진단을위한 것입니다. 유체 샘플을 측정하는 능력은 기존의 분석 기법을 위한 충분한 양의 샘플을 제공할 수 없는 다양한 생물학적 실험에서도 중요합니다. 세 번째 응용 프로그램은 살아있는 동물에서 프로브 바늘의 직접 적용으로 기울어지며, 여기서 특정 장기에서 대사 산물 또는 약물의 실시간 역학을 얻을 수 있습니다. 각 응용 프로그램에서, 우리는 MS에 의해 검출 된 분자를 추론하거나 의료 진단을 얻기 위해 인공 지능을 사용할 수 있습니다.
Introduction
질량 분석법 (MS)은 환원주의의 기술 실현이다; 분석 대상을 분자 종 또는 캐스케이드에 기초하여 해석할 수 있는 단위로 감소시킵니다. 따라서, 그것은 분석 화학의 대표적인 방법입니다. 이온화, 분석, 검출 및 스펙트럼 수집의 네 가지 프로세스로 구성됩니다. 분자의 이온화는 질량 분석법의 첫 번째 과정이기 때문에 일반적으로 처리될 분석물의 형태를 제한합니다. 대부분의 이온화 절차는 유기 시료의 구조, 형태학 및 실시간 생물학적 공정의 파괴를 요구합니다. 예를 들어, 전기 분무 이온화(ESI) MS는 효율적인 이온화를 위해 샘플이 액체 상태에 있어야 합니다1. 따라서 샘플은 분자의 구성을 변경하는 복잡한 생화학 적 준비를 거쳐야합니다. 대안적으로, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) MS는 얇은 단면 조직2,3의분자 맵을 재구성할 수 있지만, 이온화 효율이 너무 낮아 시료의 모든 분자를 검출할 수 없으며, 특히 지방산을 분석하는 데 는 좋지 않습니다. 이러한 한계를 고려하여, 프로브 전기분무 이온화(PESI)4는 구조적무결성을파괴하지 않고, 생물학적 유기체가 기술적으로 살아있는 상태에서 관찰되는 동안, 그 면에서 생물학적 시스템의 실시간 변화를 관찰하는데 사용될 수 있다. 매우 미세한 바늘은 샘플 피커와 이온 방출기로 동시에 작용하는 이 경우에 사용됩니다. 이것은 복잡한 견본 전처리 순서가 살아있는 시스템의 분자 분대를 반영하는 질량 스펙트럼을 장악하기 위하여 우회될 수 있다는 것을 의미합니다.
PESI-MS에 필적하는 몇 가지 다른 이온화 방법이 있습니다. 하나는 급속 증발 이온화 질량 분광법(REIMS)6. 이 기술은 전기 칼로 조립하고 절개 중에 생성 된 이온 깃털을 수집하기 때문에 수술 중에 잘 작동합니다. REIMS는 수술에 매우 유용하지만, 본질적으로 조직의 전기 절제가 필요한 파괴적인 방법입니다. 따라서, 예비 샘플 또는 실험실 분석에서 세포 및 조직의 상세한 분석에 유용하지 않다. 또한, 조직 파편을 포함하는 많은 양의 깃털을 수집하기 때문에 매번 사용 후 장치의 긴 유지 보수가 필요하므로이 기계의 사용을 특별한 외과 적 수술로 제한합니다. 레이저 탈착 이온화 질량 분석법(LDI-MS)7이라고하는 유사한 방법은 표면 분석에 비침습적이고 유용한 또 다른 기술입니다. 이 기술은 견본의 표면을 스캐닝에 좋기 때문에 MALDI 화상 진찰 질량 분광법8,9와 같은 포괄적인 2차원 분석을 달성합니다. 그러나, LDI-MS는 표면 분석에만 적용가능하기 때문에, PESI-MS는 예를 들어, 조직 내에서 샘플을 분석하는데 유리하다. 또 다른 기술인 MasSpec Pen10은갑상선암 진단에서 높은 특이성과 민감도를 달성하는 것으로 보고되었지만, 프로브의 직경은 mm의 순서이며 표면 분석에 특이적이며 암의 작은 결절이나 깊게 국한된 병변을 검출할 수 없다는 것을 의미합니다. 또한 이 방법은 프로브 펜에 내장된 미세 모세관 유관을 사용하므로 LDI-MS와 유사한 교차 오염을 고려해야 합니다. 유량 프로브 및 이온화 형태면봉(11)과같은 임상 설정에 적용된 다른 기술이 존재하지만, 이들은 널리 퍼지지 않는다.
PESI는 ESI의 극단적 인 소형화이며, 여기서 나노 전기 스프레이의 모세관은 수백 nm의 팁 곡률 반경을 가진 고체 바늘에 수렴된다. 이온화는 테일러 콘을 형성하여 바늘 팁의 매우 제한된 영역에서 이루어지며, 이 때 샘플은 팁의 모든 유체의 이온화가 완료될 때까지12. 금속 바늘의 끝에 있는 경우 금속 바늘과 타말물 사이의 계면에서 과량의 전하가 지속적으로 생성됩니다. 따라서 분자의 순차적 이온화는 표면 활성에 따라 발생합니다. 이 속성은 바늘 팁 크로마토 그램의 일종, 그들의 표면 활동에 따라 타액을 분리. 더 기술적으로, 더 강한 표면 활동을 가진 분자는 테일러 콘의 표면에 와서 이온화 과정이 끝날 때까지 바늘의 표면에 부착 약한 표면 활동을 가진 것보다 일찍 이온화된다. 따라서, 바늘에 의해 포착된 모든 분자의 완전한 이온화는13달성된다. 더욱이, 이 기술은 샘플에 불필요한 용매를 첨가하지 않기 때문에, 수백 개의 펨토리터는 추가 분석을 위해 충분히 강한 질량 스펙트럼을 얻기에 충분하다14. 이러한 특성은 손상되지 않은 생물학적 샘플의 분석에 유리하다. 그러나 PESI-MS의 주요 단점은 톱니 기계와 유사한 수직 축을 따라 바늘의 왕복 이동으로 인해 이온화의 불연속성에 있다. 이온화는 프로브의 팁이 이온 오리피스의 높이가 수평 축에 정렬될 때 가장 높은 지점에 도달할 때만 이루어집니다. 바늘이 샘플을 집어 들고 있는 동안 이온화가 중단되므로 이온화의 안정성은 기존 ESI와 동일하지 않습니다. 따라서 PESI-MS는 프로테오믹스에 이상적인 방법이 아닙니다.
현재까지 PESI-MS는 기초 연구에서 임상 설정에 이르는 광범위한 분야를 포괄하는 생물학적 시스템 분석에 주로 적용되었습니다. 예를 들어, 수술 동안 제조된 인간 조직의 직접 분석은 신장 세포 암종15 및 인두 편평암종16모두에서 트리아실글리세롤의 축적을 나타낼 수 있었다. 이 방법은 또한 지질 단면도에 집중하기 위하여 혈액과 같은 액체 견본을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 분자 토끼에 식이 변화 하는 동안 묘사 되었습니다.; 이 분자의 일부는 임상 진단을 위한 이 시스템의 높은 감도 및 유용성을 나타내는 실험의 초기 단계에서 감소했다고 보고되었다17. 더욱이, 살아있는 동물에게 직접 적용하면 단 1박 만에 간장의 생화학적 변화가 검출되어5. Zaitsu 등18이 실험을 다시 검토5 거의 같은 방법으로 간 대사 프로필을 분석, 안정성및 우리의 원래 방법의 재현성을 강화 결과. 더욱이, 우리는 이 기술을 사용하여 마우스에 있는 주변 비암성 간에서 암 조직을 구별할 수 있었습니다19. 따라서, 이것은 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 설정에서 유용한 다목적 질량 분석 기법이다. 또 다른 관점에서 PESI 모듈은 마운팅 어탯치먼트를 조정하여 다양한 질량 분석기에 맞게 만들 수 있습니다. 이 짧은 기사에서는 살아있는 동물을 가진 응용 프로그램을 포함하여 응용 프로그램의 기본 및 예제(그림 1)를소개합니다5.
각 국가의 규정과 법률에 따라, 이 프로토콜의 일부는 각 기관의 기준을 충족하기 위해 개정될 필요가 있을 것이다. 살아있는 유기체에 적용은 살아있는 동물에 있는 조직 또는 기관에 있는 생화확적인 또는 신진 대사 변경을 제공할 수 있기 때문에 가장 흥미롭고 도전적입니다. 이 신청서는 야마나시 대학의 동물 관리 기관위원회의 승인을 받았지만, 2013 년5에서 동물 실험에 대한 규정의 최근 변화로 인해 또 다른 승인이 필요합니다. 따라서 실험 방식의 여러 가지 수정이 권장됩니다. 실험에서 얻어진 질량 스펙트럼에 관해서는, 각 측정 사이의 질량 스펙트럼의 변동을 고려하여, 뉴클레오티드 시퀀싱 커뮤니티에 공통적인 스펙트럼 정보 공유 시스템은 없다. 작업자가 바늘을 다룰 때 특히 바늘 홀더에서 바늘을 제거할 때 바늘을 처리해야 합니다. 바늘을 분리하기위한 특수 장치는이 목적을 위해 매우 유용합니다. PESI 모듈의 구획은 밀폐된 밀폐챔버이기 때문에, 지침에 따라 질량분석기를 조작하면 이온 깃털의 누설이 발생하지 않는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PESI는 질량 분석법4에대한 ESI의 유도체이지만, 실시간 대사체학을 모니터링하는 데 가장 유리할 뿐만 아니라, 복잡하거나 시간이 많이 소요되는 전처리를 수행하지 않고 생화학 반응을 분석하는 데 가장 유리하다5,14,15,17. 그것은 살아있는 유기체의 통합 상태에 적용될 수 있는 쉽고…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이즈카 아유미씨는 PESI-MS와 사와노보리 가즈코의 비서 지원을 받아 운영해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 원고의 초안을 편집해 주신 에단츠 그룹(www.edanzediting.com/ac)의 브론웬 가드너 박사께 감사드립니다.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
Referencias
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology – Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
