原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ
Summary
本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。
Abstract
神経伝達の成長は、神経系の発達中の神経回路の形成における基本的な出来事である。重度の神経剤損傷およびシナプス機能障害は、様々な神経変性疾患および加齢に伴う変性に起こる。神経伝達物質の成長を調節するメカニズムの研究は、脳の発達過程だけでなく、そのような神経疾患にも貴重な光を当てるだろう。トランスフェクション効率が低いため、一次哺乳類ニューロンの神経伝達体外増殖に対する特定のタンパク質の影響を研究することは現在困難です。ここでは、EGFPと目的タンパク質(POI)を用いて一次ラット皮質ニューロンの共トランスフェクションによる神経質の成長を調べる簡単な方法について述べる。この方法は、EGFP信号を介してPOIトランスフェクトニューロンの同定を可能にし、したがって、神経突起成長に対するPOIの効果を正確に決定することができる。このEGFPベースのアッセイは、ニューライトの成長を調節する経路の調査に便利なアプローチを提供します。
Introduction
軸とデンドライトの両方を含むニューライトは、ニューラルネットワークの確立に関与するニューロンからの投影である。神経伝達物の動的な成長は神経発達に不可欠である。しかし、その下にある規制メカニズムは不明のままである。特に、神経質損傷は、様々な神経変性疾患および脳損傷後1でしばしば観察される。したがって、様々なニューライト成長調節経路における置き起分子の役割の調査は、プロセスの理解を向上させるだろう。さらに、様々な神経障害に対する新しい治療標的を明らかにしてもよい。神経細胞株は、神経伝達を含む神経細胞プロセスを研究するための貴重なモデルであり、操作とトランスフェクトが容易である2、3.しかし、遺伝的ドリフトは、いくつかの一般的に使用される細胞株で起こることが報告されており、これは彼らの生理的応答のばらつきにつながる可能性があります4.さらに、分タンパク質発現は、ニューロン細胞株と一次ニューロンとの間で示されている。例えば、PC12は、神経伝達体の成長2、3の研究に広く用いられているラット副腎に由来する神経細胞株であり、NMDA受容体5を発現しない。さらに、一次ニューロンと比較して神経芽細胞腫ライン神経-2aの反応性の低下は、特定の膜受容体およびイオンチャネル6の発現の欠如によるものであることが提案されている。したがって、一次ニューロンは、神経伝達体の成長の調査のためのより望ましい代表的なモデルである。しかし、一次ニューロンの使用は、その低いトランスフェクション効率7によって妨げられる。
ここでは、目的タンパク質(POI)とEGFPを一次ラット皮質ニューロンに対する共トランスフェクションを伴う方法について説明する。EGFPは正常にトランスフェクトされたニューロンの同定のための形態学的マーカーとして作用し、神経突起の測定を可能にする。この方法は、ニューライトの成長を調節すると報告されている化合物/分子を用いて検証した。また、FE65は、ニューライトの成長を刺激することが示されているニューロンアダプタータンパク質であり、このアプローチ8,9を例示するために用いられた。このプロトコルは、(1)胚18日目(E18)ラット胚からの一次皮質ニューロンの単離、(2)EGFPとPOI(本研究におけるFE65)とのニューロンの共トランスフェクション、(3)画像処理を用いてニューロンのイメージングと解析を含む。ニューロンJプラグイン10、11を持つソフトウェアImageJ。
Protocol
すべての手順は、香港中華大学の動物実験倫理委員会の倫理基準に従っていました. 1. カバースリップの準備 無菌の18mm円形カバーを12ウェル組織培養板の各ウェルに入れます。 カバースリップを加湿した37°Cインキュベーターで5 μg/mLポリD-リジン溶液で少なくとも1時間コートします。 組織培養プレートからポリD-リジン溶液を吸引し、被覆された?…
Representative Results
この方法論をテストするために、我々は、それぞれ14、15、16の神経伝達体の成長を阻害し、刺激することが示されているCyto Dおよび神経成長因子NGFを使用した。EGFPでトランスフェクトされたニューロンの神経突起長は、Cyto DまたはNGFによる治療後に測定した。EGFPのニューロンへのトランスフェク?…
Discussion
前述したように、PC12およびそのサブクローンは、優れたトランスフェクション効率2、3を持っているので、神経伝達拡張を研究するために広く使用されています。対照的に、一次ニューロンはトランスフェクション速度が低く、トランスフェクション7による神経伝達成長調節因子の研究の大きな障害となっている。ここでは、一?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、研究助成金協議会香港、保健医療研究基金(香港)、CUHK直接助成金スキーム、ユナイテッドカレッジ基金、TUYF慈善信託からの資金によって支援されました。
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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Citar este artículo
Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L. D., Lau, K. An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (152), e60031, doi:10.3791/60031 (2019).