Técnicas de Espectrometría de Masa de Movilidad de Iones para Determinar la Estructura y Mecanismos de Reconocimiento de Iones Metálicos y Actividad Redox de Oligopéptidos de Unión De Metal
Summary
Las técnicas de modelado molecular y espectrometría de masas de movilidad ión pueden caracterizar el rendimiento selectivo de quelantes metálicos de los péptidos de unión a metales diseñados y el péptido de unión de cobre methanobactin. El desarrollo de nuevas clases de péptidos quelantes metálicos ayudará a llevar a terapias para enfermedades asociadas con el desequilibrio de iones metálicos.
Abstract
La ionización por electrospray (ESI) puede transferir un péptido de fase acuosa o un complejo de péptidos a la fase gaseosa, al tiempo que conserva su masa, carga general, interacciones de unión de metales y forma de conformación. El acoplamiento ESI con espectrometría de masas de movilidad ión (IM-MS) proporciona una técnica instrumental que permite la medición simultánea de la sección transversal de masa a carga (m/z) y de colisión (CCS) de un péptido que se relacionan con su estequiometría, estado de protonación, y forma conformacional. La carga general de un complejo de péptidos se controla mediante la protonación de 1) los sitios ácidos y básicos del péptido y 2) el estado de oxidación de los iones metálicos. Por lo tanto, el estado de carga general de un complejo es una función del pH de la solución que afecta a los péptidos de la afinidad de unión de iones metálicos. Para los análisis ESI-IM-MS, las soluciones de péptidos e iones metálicos se preparan a partir de soluciones solo acuosas, con el pH ajustado con ácido acético acuoso diluido o hidróxido de amonio. Esto permite determinar la dependencia del pH y la selectividad de iones metálicos para un péptido específico. Además, el m/z y el CCS de un complejo de péptidos se pueden utilizar con el modelado molecular B3LYP/LanL2DZ para discernir los sitios de unión de la coordinación de iones metálicos y la estructura terciaria del complejo. Los resultados muestran cómo ESI-IM-MS puede caracterizar el rendimiento de quelación selectiva de un conjunto de péptidos alternativos de methanobactina y compararlos con el péptido de unión de cobre methanobactin.
Introduction
Los iones de cobre y zinc son esenciales para los organismos vivos y cruciales para procesos como la protección oxidativa, el crecimiento del tejido, la respiración, el colesterol, el metabolismo de la glucosa y la lectura del genoma1. Para habilitar estas funciones, grupos como el tiolato de Cys, el imidazol de Su2,3, (más raramente) tioéter de metionina, y carboxilato de Glu y Asp incorporan selectivamente metales como cofactores en los sitios activos de metaloenzimas. La similitud de estos grupos de coordinación plantea una pregunta intrigante sobre cómo los ligandos Suyos y De Los Cys incorporan selectivamente Cu(I/II) o Zn(II) para asegurar el correcto funcionamiento.
La unión selectiva se realiza a menudo mediante la adquisición y el tráfico de péptidos, que controlan las concentraciones iónquires de Zn(II) o Cu(I/II)4. Cu(I/II) es altamente reactivo y causa daño oxidativo o unión adventicia a las enzimas, por lo que su concentración libre está estrechamente regulada por chaperones de cobre y proteínas reguladoras de cobre que lo transportan de forma segura a varios lugares de la célula y estrechamente controlar su homeostasis5,6. La interrupción del metabolismo del cobre o la homeostasis está directamente implicada en la enfermedad de Menkes y Wilson7, así como en los cánceres7 y trastornos neuronales, como el prión8 y la enfermedad de Alzheimer9.
La enfermedad de Wilson se asocia con el aumento de los niveles de cobre en los ojos, el hígado y las secciones del cerebro, donde las reacciones redox de Cu(I/II) producen especies reactivas de oxígeno, causando degeneración hepatolenticular y neurológica. Las terapias de quelación existentes son el pequeño aminoácido tiol penicilamina y trietiletetramina. Alternativamente, los péptidos metanotropoficos de adquisición de cobre methanobactin (mb)10,11 exhiben potencial terapéutico debido a su alta afinidad de unión para Cu(I)12. Cuando el methanobactin (mb-OB3b) de Methylosinus trichosporium OB3b fue estudiado en un modelo animal de la enfermedad de Wilson, el cobre fue eliminado eficientemente del hígado y excretado a través de la bilis13. Los experimentos in vitro confirmaron que mb-OB3b podría quelar el cobre del metalotionino de cobre contenido en el citosol hepático13. Las técnicas de imágenes de espectrometría de masas plasmáticas acopladas inductivamente de ablación láser han investigado la distribución espacial del cobre en las muestras hepáticas de la enfermedad de Wilson14,15,16 y han demostrado que mb-OB3b elimina el cobre con períodos de tratamiento cortos de sólo 8 días17.
El mb-OB3b también se unirá a otros iones metálicos, incluidos Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) y Zn(II)18,19. La competencia por el sitio de unión fisiológico Cu(I) es exhibida por Ag(I) porque puede desplazar a Cu(I) del complejo mb-OB3b, con Ag(I) y Ni(II) mostrando también unión irreversible a Mb que no puede ser desplazada por Cu(I)19. Recientemente, se han estudiado una serie de oligopéptidos alternativos de methanobactina (amb) con el motivo de unión 2His-2Cys20,21,y sus propiedades de unión Zn(II) y Cu(I/II) caracterizadas. Sus secuencias de aminoácidos primarios son similares, y todas contienen el motivo 2His-2Cys, Pro y un cesación acetilado N-terminus. Se diferencian principalmente de mb-OB3b porque el motivo 2His-2Cys reemplaza los dos sitios de unión de oxazolona de enethiol de mb-OB3b.
La ionización por electrospray junto con la espectrometría de masas de movilidad ión (ESI-IM-MS) proporciona una poderosa técnica instrumental para determinar las propiedades de unión al metal de los péptidos porque mide su masa a carga (m/z) y la colisión sección transversal (CCS) conservando su masa, carga y forma de conformación de la fase de solución. El m/z y el CCS se relacionan con los péptidos etoquiometría, estado de protonación y forma de conformación. La estequiometría se determina porque la identidad y el número de cada elemento presente en la especie se identifican explícitamente. La carga general del complejo de péptidos se relaciona con el estado de protonación de los sitios ácidos y básicos y el estado de oxidación de los iones metálicos. El CCS proporciona información de la forma conformacional del complejo peptídico porque mide el tamaño medio rotacional que se relaciona con la estructura terciaria del complejo. El estado de carga general del complejo también es una función del pH y afecta a la afinidad de unión de iones metálicos del péptido porque los sitios básicos o ácidos desprotonados como el carboxilo, His, Cys y Tyr son también los sitios de unión potenciales para el ion metálico. Para los análisis, el péptido y el ion metálico se preparan en soluciones acuosas con el pH ajustado por ácido acético acuoso diluido o hidróxido de amonio. Esto permite determinar la dependencia del pH y la selectividad de iones metálicos para el péptido. Además, el m/z y el CCS determinados por ESI-IM-MS se pueden utilizar con el modelado molecular B3LYP/LanL2DZ para descubrir el tipo de coordinación de iones metálicos y la estructura terciaria del complejo. Los resultados mostrados en este artículo revelan cómo ESI-IM-MS puede caracterizar el rendimiento de quelación selectiva de un conjunto de péptidos amb y compararlos con el péptido de unión de cobre mb-OB3b.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos: conservación de comportamientos en fase de solución para su examen a través de ESI-IM-MS
Se deben utilizar ajustes instrumentales nativos ESI que conserven la estequiometría de los péptidos, el estado de carga y la estructura de conformación. Para condiciones nativas, las condiciones en la fuente ESI tales como los voltajes del cono, las temperaturas y los flujos de gas tienen que ser optimizados. Además, las presiones y voltajes en la fuente, la trampa, la movilidad iónica y …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo 1764436, el apoyo a instrumentos NSF (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014) y recursos informáticos del Departamento de Energía (TX-W-20090427-0004-50) y L3 Communications . Agradecemos al grupo Bower de la Universidad de California – Santa Bárbara por compartir el programa Sigma y Ayobami Ilesanmi por demostrar la técnica en el video.
Materials
| acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
| copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
| copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
| designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
| designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
| Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
| glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
| lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
| poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
| zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |
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