Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

Summary

Aqui apresentamos um método simples para medir a atividade da quitinase em fluidos biológicos, como lavagem broncoalveolar ou soro.

Abstract

As quitinases são as enzimas que cliam em quitina. Mesmo na ausência de quitina, os mammalianos têm quantidades significativas de quitinases presentes no corpo, incluindo no início do estudo. O papel preciso da quitinase não é conhecido, no entanto, acreditava-se que desempenham um papel importante na digestão e defesa do hospedeiro contra a quitina contendo alimentos e patógenos, respectivamente. O trabalho recente, incluindo o nosso, tem demonstrado um papel importante de quitinase e proteínas de quitinase-like na imunidade do hospedeiro e doenças alérgicas. É importante ressaltar que as atividades de quitinase servem como biomarcadores importantes da severidade da doença em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças inflamatórias do tipo 2, como asma e fibrose pulmonar. Da mesma forma, pacientes com distúrbios genéticos como a doença de Gaucher têm níveis significativamente elevados de quitinase, que não só se correlacionam com a severidade da doença, mas também servem como um biomarcador confiável para efetividade terapêutica. O protocolo esboçado aqui descreve uma maneira simples, rápida, e direta de medir a atividade do quitinase no Bal ou em amostras do soro dos ratos e pode extensamente ser adaptado aos assuntos humanos e aos outros organismos modelo devido à natureza altamente conservada das enzimas.

Introduction

A quitina é o segundo polissacárido mais abundante na terra após a celulose, servindo como um componente estrutural importante de uma variedade de organismos, incluindo o exoesqueleto de insetos, fungos, leveduras e algas; alguns vertebrados também têm quitina¹. Quitinases são uma família de enzimas que são capazes de quebrar a quitina e são altamente conservadas ao longo da evolução em espécies que variam de bactérias a mamíferos^2,3. Além de quitinases, os mamíferos também têm quitinase-como proteínas que são semelhantes às quitinases em sua capacidade de ligar a quitina, mas diferem em que falta capacidade enzimática para Cleave a quitina⁴.

Embora a quitina e as quitinases tenham sido estudadas há muito tempo — com investigações que datam do início de 1900 — o foco principal tem sido o seu papel em insetos e outros invertebrados. Na verdade, não foi até a década de 1960, quando os vertebrados foram encontrados para ter quitinases em tudo. Usando um ensaio à base de quitobiase, as quitinases mostraram-se no trato digestivo de um número de vertebrados, incluindo lagartos e melros — uma observação hipotética para ser devido ao consumo de organismos contendo quitina, como insetos⁵ .

Os mamíferos têm duas formas enzimaticamente ativas de quitinase: quitinase de mamíferos ácidos (AMCase; também conhecida como CHIT2 e CHIA) e quitotriosidase (CHIT1)⁴. Ambas as proteínas são capazes de hidrolisando quitina. No entanto, CHIT1 é mais enzimaticamente ativo em seres humanos, onde quase toda a atividade de quitinase é derivada de CHIT1. ⁴ em camundongos, tanto o Chit1 quanto o amcase contribuem quase igualmente para a atividade geral da quitinase⁶. Por outro lado, as proteínas quitinase-like falta de atividade quitinase.

Chit1 é secretado principalmente por macrófagos e é muitas vezes considerado uma resposta imune aos patógenos contendo quitina⁷. A enzima também demonstrou estar envolvida na maturação dos monócitos nos subtipos de macrófago M1 e m2, mesmo sem a presença do substrato quitina⁸. Além disso, também pode estar envolvida na maturação de outras células imunes, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2) e eosinófilos — como se mostrou ser o caso na infecção pulmonar criptocócica⁹. Estes estudos apontam para um papel complexo de quitinases no sistema imunológico.

Nos últimos anos, Chit1 níveis foram encontrados para servir como um importante biomarcador de progressão para mais de 40 diferentes doenças humanas, incluindo doenças de armazenamento lisossomal, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças endocrinológicas, cardiovascular doenças neurológicas e outras (revistas¹⁰). Em muitas dessas doenças, os níveis de Chit1 são um forte preditor de severidade da doença e efetividade terapêutica¹⁰.

Como quitinases ganharam uma reputação como um biomarcador para inúmeras condições médicas, incluindo a doença de Gaucher, ferramentas e ensaios foram desenvolvidos para facilitar o teste para a presença de quitinase. Os métodos mais antigos incluem o procedimento de schales, um protocolo adaptado de um teste de glicose no sangue, e o método de ácido 3, 5 dinitrosalicílico (DNS). No entanto, esses métodos são muitas vezes sensíveis ao tempo e tecnicamente difícil¹¹. O procedimento para ambos os testes exige a redução de oxidantes inorgânicos, ferricianeto no caso do schales ‘ procedimento por exemplo, produzindo uma mudança de cor que só pode ser medido espectrofotometricamente. Adicionalmente, ambos os testes envolvem um aquecimento ou uma etapa de ebulição que seja demorado e necessário para que a cor desenvolva^12,13.

Descrito aqui é um ensaio fluimétrico rápido e simples para determinar os níveis de quitinase em amostras de mamíferos^14,15. Duas das amostras utilizadas aqui incluem fluidos de lavagem de soro e broncoalveolar (LBA); a atividade da quitinase também foi mensurada em amostras de leite materno e urina, e a técnica pode ser realizada nessas amostras, bem como em qualquer outro fluido biológico^16,17.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados um protocolo aprovado pela IACUC na Yale University School of Medicine. 1. coleção de amostras de mouse Anesthetization Anestesie os camundongos com cetamina e xilazina (100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina). Coleta de amostras de sangue Confirme a profundidade da anestesia por não-responsividade a uma pitada do dedo do pé. Abra cirurgi…

Representative Results

Os resultados mostrados aqui são de um estudo que mede a atividade da quitinase em amostras do soro e do Bal do tipo selvagem (C57Bl/6) e de ratos transgênicas Chit1 (no fundo C57Bl/6) que sobre-expressão o gene Chit1 em um promotor do doxiciclina. Nossos dados mostram que as amostras do soro e do Bal têm a atividade detectável do quitinase na linha de base 698,2 ± 189,9 nmol/ml · h e 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectivamente. A superexpressão do gene Chit1 utilizando doxiciclina em água potável por 4 semanas …

Discussion

A atividade da quitinase surgiu como um importante biomarcador para prever a severidade da doença, a progressão da doença, a efetividade terapêutica e a presença de patógenos específicos¹⁸. Embora muitas das teorias há muito postuladas sobre o papel das quitinases não tenham sido experimentalmente comprovadas¹⁹, novos estudos têm proporcionado importantes insights sobre o papel das quitinases e quitinase como proteínas em várias doenças²…

Materials

4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate			for use in McIlvain Buffer
Glycine			for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O			for use in McIlvain Buffer
NaOH			for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate	4titude	4ti-0224