המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב
Summary
האסטרולוגים הם תאים מורכבים מורפולוגית, לידי ביטוי על ידי התהליכים המרובים שלהם בשטחים סבוך. כדי לנתח את המבנה המשוכלל שלהם, אנו מציגים פרוטוקול אמין כדי לבצע לוציפר תאיים ביוטופהורזיס צהוב בעדינות רקמה קבועה.
Abstract
אסטרוציטים הם מרכיבים חיוניים של מעגלים עצביים. הם לקלף את כל מערכת העצבים המרכזית (CN) והם מעורבים במגוון של פונקציות, אשר כוללות סיווג נוירוטרנסמיטר, רגולציה יון, אפנון סינפטית, תמיכה מטבולית לנוירונים, ובקרת זרימת הדם. Astrocytes הם תאים מורכבים בעלי סומה, כמה ענפים גדולים, ותהליכים משובחים רבים ליצור קשר עם אלמנטים סלולריים מגוונים בתוך נוירופיל. על מנת להעריך את המבנה של האסטרוציטים, יש צורך בשיטה אמינה ומועלת כדי להמחיש את המבנה שלהם. אנו מדווחים על פרוטוקול אמין לבצע iontophoresis של האסטרוציטים באמצעות פלורסנט לוציפר צהוב (LY) לצבוע בקלות רקמת מוח קבוע מעכברים למבוגרים. שיטה זו כוללת מספר תכונות שימושיות לאפיון מורפולוגיה אסטרוציט. זה מאפשר שחזור תלת מימדי של אסטרוציטים בודדים, אשר שימושי לבצע ניתוחים מורפולוגיים על היבטים שונים של המבנה שלהם. אימונוהיסטוכימיה יחד עם באופן LY יכול להיות מנוצל כדי להבין את האינטראקציה של אסטרוציטים עם רכיבים שונים של מערכת העצבים להעריך את הביטוי של חלבונים בתוך האסטרוציטים המסומנת. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במגוון של מודלים העכבר של הפרעות מערכת העיכול כדי לבחון בקפדנות מורפולוגיה אסטרוציט עם מיקרוסקופ אור. מספק גישה ניסיונית להערכת מבנה אסטרוציט, במיוחד בהקשר של פציעה או מחלה שבה תאים אלה מוצעים לעבור שינויים מורפולוגיים משמעותיים.
Introduction
Astrocytes הם התאים הנפוצים ביותר גליה במערכת העצבים המרכזית (cn). הם משחקים תפקידים הומאוסטזיס יון, בקרת זרימת הדם, היווצרות סינפסה, כמו גם חיסול, ו הנוירוטרנסמיטור קליטת1. מגוון רחב של פונקציות אסטרוציט משתקף במבנה מורפולוגית המורכבת שלהם2,3. Astrocytes מכילים מספר ענפים עיקריים ומשניים אשר מתחלקים לאלפי ברשופטים עדין ועלונים כי אינטראקציה ישירה עם הסינפסות, דנדריטים, אקסונים, כלי דם, ותאים גליה אחרים. מורפולוגיה astrocyte משתנה בין אזורי מוח שונים, אשר עשוי לרמוז על יכולתם לבצע את תפקידם באופן מכריע במעגלים עצביים4. יתר על כן, האסטרוציטים ידועים לשנות את המבנה שלהם במהלך הפיתוח, במהלך התנאים הפיזיולוגיים, ובמדינות מחלות מרובות3,5,6.
שיטה עקבית ומדומה נחוצה כדי לפתור במדויק את המורכבות של המבנה האסטרוציט. באופן מסורתי, אימונוהיסטוכימיה נעשה שימוש כדי להמחיש אסטרוציטים עם שימוש ספציפי אסטרוציט מועשר חלבון סמנים. עם זאת, שיטות אלה לחשוף את התבנית של ביטוי חלבון ולא את המבנה של astrocyte. סמנים בשימוש נפוץ, כגון חלבון מסוג גליה fibrillary (gfap) ו S100 סידן כריכת חלבון β (S100β), לא לבטא את עוצמת הקול כולו, ובכך לא לפתור מורפולוגיה מלאה7. גישות גנטיות לבטא חלבונים פלואורסצנטי באופן מהיר ב אסטרוציטים (זריקות נגיפי או שורות כתב העכבר הטרנסגניים) יכול לזהות את הענפים עדין והשטח הכולל. עם זאת, קשה להבדיל אסטרוציטים בודדים, וניתוחים עשויים להיות מוטה על ידי אוכלוסיית אסטרוציט ממוקדות על ידי יזם מסוים8. מיקרוסקופ מקטע סדרתי משמש כדי לחשוף תמונה מפורטת של האינטראקציות של תהליכים אסטרוציט עם הסינפסות. בשל אלפי תהליכים אסטרוציט יצירת קשר עם הסינפסות, כרגע זה לא אפשרי לשחזר תא שלם עם טכניקה זו9, למרות זאת צפוי להשתנות עם השימוש בגישות למידה מחשב עבור ניתוח נתונים.
בדו ח זה, אנו מתמקדים בהליך לאפיין את האסטרוציטים העכבר באמצעות ביוטוהורזיס תאיים עם לוציפר צהוב (LY) צבע, באמצעות CA1 שכבה רדיואטום כדוגמה. השיטה מתבססת על עבודת העבר החלוצית של אריק בושונג ומארק אליסמן10,11. האסטרוציטים מפרוסות המוח קבוע בקלות מזוהים על ידי הצורה הייחודית שלהם וממולא LY. לאחר מכן התאים מתתמונות עם המיקרוסקופיה הקונפוקלית. אנו מדגימים כיצד משמש באופן LY iontophoresis לשחזר אסטרוציטים הפרט ולבצע ניתוחים מורפולוגיים מפורטים של התהליכים שלהם טריטוריה. גם, שיטה זו יכולה להיות מיושם בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות יחסים מרחביים ואינטראקציות בין אסטרוציטים ונוירונים, תאים גליאל אחרים, והמוח המערכת. אנו מחשיבים באופן ככלי מתאים מאוד לניתוח מורפולוגיה באזורי מוח שונים ומודלים של עכברים בתנאים בריאים או מהמחלה7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארים במאמר זה מתארת דרך להמחיש מורפולוגיה אסטרוציט באמצעות ביוטוזיס תאיים של צבע LY בפרוסות מוחית בקלות. קיימים מספר גורמים קריטיים המסומנים בפרוטוקול זה, התורמים לשחזור מוצלח של התאים ולשיחזור מורפולוגי. גורם אחד הוא האיכות והתוכסות של התמונות, אשר נקבע במידה רבה על ידי גיל העכ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לגב סוטו, ד ר יו וד ר אוקטו להדרכה, כמו גם הערות על הטקסט. עבודה זו נתמכת על-ידי NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
Referencias
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurociencias. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
