다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성
Summary
상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.
Abstract
인간 자궁 내부증은 바디에 있는 가장 호르몬 반응하는 조직 의 한개이고 임신의 설치를 위해 필수적입니다. 이 조직은 또한 병에 걸린 될 수 있고 이환율및 죽음조차 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 인간 자궁내막 생물학을 연구하는 모델 시스템은 단일 세포 유형의 체외 배양 시스템으로 제한되었다. 또한, 자궁 내막의 주요 세포 유형 중 하나인 상피 세포는 잘 전파되거나 배양에서 생리적 특성을 유지하지 못하므로 자궁내막 생물학에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 우리는 처음으로 인간 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포로 구성된 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 이러한 오르가노이드는 어떤 외인성 스캐폴드 물질을 필요로 하지 않으며 상피 세포가 스페로이드와 같은 구조를 포괄하고 콜라겐을 생성하고 분비하는 중심에 있는 기질 세포와 편광되도록 특별히 조직한다. 에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체는 상피 및 기질 세포및 에스트로겐 및 테스토스테론의 생리적 수준으로 치료하여 오르가노이드의 조직을 촉진한다. 이 새로운 모형 체계는 전에 가능하지 않은 방법으로 일반적인 자궁내막 생물학 및 질병을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
인간 자궁 내막은 자궁 구멍을 일렬로 세게 하고 이식 도중 태아를 위한 첫번째 접촉으로 봉사합니다. 자궁 내막은 발광 및 선 상피 세포, 지지성 기질 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포로 구성됩니다. 함께, 이러한 세포 유형은 성 스테로이드 호르몬에 가장 반응 조직 중 하나입니다 자궁 내막 조직을 구성1. 각 생리 주기 동안 발생 하는 변화는 눈에 띄는. 자궁 내적의 적절한 성장 및 리모델링은 배아 이식이 발생할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 에스트로겐과 프로게스테론에 대한 비정상적인 반응은 임신의 성공적인 설립을 허용하지 않는 내화 자궁 내막을 초래할 수 있으며 자궁 내막 신생물을 포함한 질병을 초래할 수도 있습니다.
자궁 내막에서 발생하는 호르몬 반응 및 필수 변화를 연구하기 위해, 수술 또는 자궁 내막 생검 동안 환자로부터 절제 된 자궁 내막 조직에서 세포는 세포 배양에서 전파되었습니다. 자궁내막 기질 세포는 우선적으로 증식하고 쉽게 전파되며, 프로게스테론에 의해 유도된 분화 과정은 시험관 내에서 재흡수될 수 있다. 그 결과, 이러한 분화 과정에서 많은 것을 배웠으며,2,3. 자궁 내막에 있는 그밖 중요한 세포 모형은, 발광 및 선 상피 세포, 그러나, 전통적인 단층으로 잘 성장하지 않으며, 극성을 잃고, 노화되고, 및 제한된 증식 잠재력을 가진. 그 결과, 그들의 생물학및 인간 자궁 내적에서그들의 역할의 더 적은 알려지다. 많은 신생아가 상피 세포에서 유래하는 것처럼, 증식 또는 암세포에 의한 형질전환과 관련된 메커니즘은 완전히 정의될 수 있습니다. 게다가, 연구 결과는 호르몬 반응이 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포 사이 친밀한 paracrine 활동을 관련시키는 것을설치했습니다4,5.
최근, 자궁내막 상피 세포의 3차원(3D) 오르가노이드 배양은 자궁내막 조직에서 형성된 오르가노이드의 첫 번째 보고인 2개의 독립적인 그룹6,7에의해 확립되었다. 이들 오르가노이드는 단백질 매트릭스(Tableof Materials)내에 내장된 자궁내막 상피 세포로 구성되었으며 자궁내막 자궁내막, 기질 섬유아세포의 중요한 호르몬 반응 구획을 포함하지 않았다. 매트릭스 단백질은 로트마다 다를 수 있고 조직에서 반드시 발생하지 않는 신호 경로를 트리거 할 수 있으므로 매트릭스 단백질을 자궁 내적의 구성 요소로 대체하는 것이 이상적입니다. 현재 연구에서는, 인간 자궁내막의 상피 및 기질 세포의 비계가 없는 인간 자궁내막 오르가노이드를 생성하는 프로토콜이 제시된다. 기질 세포의 존재는 상피 세포에 대한 지원을 제공 할뿐만 아니라 자궁 내막 호르몬반응에중요하도록 설립 된 필요한 paracrine 작업을 제공합니다4,8,9 .
새로운 다세포 자궁내막 오르가노이드는 생성이 간단하고 상피 세포와 기질 세포를 모두 통합하는 자궁 내막의 모형 시스템을 제공합니다. 이 organoids는 호르몬 불균형 또는 외인성 모욕 때문에 종양 발생과 같은 질병의 장기 호르몬 변경 그리고 초기 사건을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 organoids의 복잡성은 결국 진정으로 인간 조직 생리학을 모방하기 위하여 가능하게 근심 세포와 내피 및 면역 세포를 포함하여 그밖 세포 모형을 포함하도록 확장될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 외인성 스캐폴드 물질을 사용하지 않고 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 1차 자궁내막 상피 세포가 오르가노이드6,7을형성할 수 있다는 것이 이미 나타났지만, 이들 세포는 마우스 육종 세포에 의해 분비된 단백질의 젤라틴 매트릭스에 내장되었다(재료 표참조). 형성 스페로이?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIEHS/NIH/NCATS UG3 교부금(ES029073)과 노스웨스턴 페인버그 의과 대학 기금(JJK)에 의해 지원되었습니다. 우리는 파라핀 포함을 위한 고정된 오르가노이드를 처리하기 위한 노스웨스턴 병리학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다. 우드럽, 버데트, 어반크 연구소를 포함한 UG3 팀 전체가 통찰력 있는 토론과 협업을 위해 인정하고 싶습니다.
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
Referencias
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