Mesurer les effets des bactéries et des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans
Summary
Ce protocole décrit comment mesurer la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. Cette méthode est utile pour la recherche biologique fondamentale sur la santé intestinale liée à l’interaction entre les bactéries intestinales et leur hôte et pour le dépistage pour identifier les agents probiotiques et chimiques pour guérir le syndrome de l’intestin qui fuit et les maladies inflammatoires de l’intestin.
Abstract
Chez les organismes vivants, l’hyperperméabilité intestinale est un symptôme grave qui conduit à de nombreuses maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Caenorhabditis elegans est un modèle animal non-mammalien qui est largement utilisé comme un système d’analyse en raison de sa courte durée de vie, la transparence, la rentabilité, et le manque de questions d’éthique animale. Dans cette étude, une méthode a été développée pour étudier les effets de différentes bactéries et 3,3′-diindolylmethane (DIM) sur la perméabilité intestinale de C. elegans avec un système d’analyse d’image à haut débit. Les vers ont été infectés par différentes bactéries intestinales ou cotraités avec DIM pendant 48 h et nourris avec de la fluorescéine isothiocyanate (FITC)-dextran pendant la nuit. Ensuite, la perméabilité intestinale a été examinée en comparant les images de fluorescence et l’intensité de fluorescence à l’intérieur des corps de ver. Cette méthode peut également avoir le potentiel d’identifier les bactéries intestinales probiotiques et pathogènes qui affectent la perméabilité intestinale dans le modèle animal et est efficace pour examiner les effets des produits chimiques nocifs ou favorisant la santé sur la perméabilité intestinale et la santé intestinale. Cependant, ce protocole a également quelques limitations considérables au niveau génétique, particulièrement pour déterminer quels gènes sont modifiés pour commander la maladie, parce que cette méthode est principalement employée pour la détermination phénotypique. En outre, cette méthode se limite à déterminer exactement quels substrats pathogènes causent l’inflammation ou augmentent la perméabilité des intestins des vers pendant l’infection. Par conséquent, d’autres études approfondies, y compris l’étude du mécanisme génétique moléculaire à l’aide de bactéries mutantes et de nématodes ainsi que l’analyse des composants chimiques des bactéries, sont nécessaires pour évaluer pleinement la fonction des bactéries et des produits chimiques dans la détermination de la perméabilité intestinale.
Introduction
La perméabilité intestinale est considérée comme l’un des principaux obstacles liés au microbiote intestinal et à l’immunité muqueuse et est susceptible d’être affectée par plusieurs facteurs, tels que les modifications du microbiote intestinal, l’affaiblissement épithélial ou les altérations de la couche de muqueuse1. Des articles récents ont rapporté des protocoles efficaces pour mesurer la perméabilité intestinale des cellules intestinales humaines cultivées en analysant les taux de flux de fluorescence à travers la couche de cellules intestinales2, mais moins d’articles de recherche présentent une procédure appropriée pour mesurer la perméabilité intestinale dans les nématodes, en particulier chez C. elegans, en utilisant la coloration FITC-dextran.
Il existe deux protocoles représentatifs pour mesurer la perméabilité intestinale chez C. elegans à l’aide du rouge du Nil3 et de l’erioglaucine disodium (ou de l’assème schtroumpf)4,5. Dans ce protocole, nous avons utilisé FITC-dextran (poids moléculaire moyen 10 000), qui a un poids moléculaire beaucoup plus élevé que le rouge nil (MW 318,37) et le disodium erioglaucine (MW 792,85). FITC-dextran est plus semblable que le rouge du Nil ou les colorants disodium erioglaucine aux nutriments macromoléculaires réels tels que les hydrates de carbone, qui sont absorbés par la couche intestinale. La perméabilité intestinale de C. elegans nourris avec de l’erioglaucine disodium (colorant bleu Schtroumpf) peut être facilement évaluée sans microscopie de fluorescence. Cependant, dans l’analyse schtroumpf, l’analyse quantitative de la perméabilité intestinale est difficile en raison de l’absence de normalisation et doit être évaluée manuellement4,5. Dans le cas de l’assidu rouge du Nil, le rouge du Nil tache également des gouttelettes lipidiques dans les cellules, ce qui peut interférer avec la détermination exacte de la perméabilité intestinale chez C. elegans6. Les protocoles actuels permettent une analyse quantitative rapide et précise de la perméabilité intestinale chez C. elegans traités avec diverses bactéries intestinales et produits chimiques tout en évitant la coloration lipidique non spécifique.
C. elegans est un modèle typique dans les domaines biologiques en raison de son prix abordable, manipulation facile, questions limitées d’éthique animale, et la durée de vie courte, ce qui est bénéfique pour l’expérimentation rapide7. En particulier, après la publication de l’ensemble du génome de C. elegans, près de 40 % des gènes du génome de C. elegans se sont avérés orthologues pour les gènes qui causent des maladies humaines8. En outre, le corps transparent permet l’observation à l’intérieur de l’organisme, ce qui est avantageux pour la recherche d’événements cellulaires et pour les applications de fluorescence en biologie cellulaire, par exemple, la coloration des cellules souches avec DAPI ou immunohistochimie9. C. elegans est souvent utilisé comme animal expérimental pour étudier l’interaction entre le microbiote intestinal et l’hôte; en outre, C. elegans est utilisé pour dépister les bactéries probiotiques favorisant la santé10,11,12 ainsi que des produits chimiques alimentaires favorisant la santé intestinale13,14.
Pseudomonas aeruginosa et Enterococcus faecalis sont des bactéries intestinales bien connues qui affectent négativement le système gastro-intestinal, en particulier les cellules épithéliales du côlon du tractus intestinal15,16. Par conséquent, la mesure de la perméabilité intestinale déclenchée par ces bactéries est nécessaire pour le dépistage et le développement de nouveaux médicaments qui peuvent récupérer et réduire les dommages causés par l’inflammation bactérienne et l’infection. Dans ce protocole, nous avons testé les effets de ces bactéries intestinales sur la perméabilité intestinale de C. elegans.
Nous rapportons également un protocole optimisé pour tester des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de C. elegans. À cette fin, nous avons utilisé 3,3′-diindolylméthane (DIM) comme un produit chimique modèle parce que DIM est un composé de métabolite bioactif dérivé de l’indole-3-carbinol, qui est présent dans les usines alimentaires Debrasica, et a été rapporté pour avoir des effets thérapeutiques sur les MII chez les souris17,18. En outre, nous avons récemment découvert que DIM améliore le dysfonctionnement de perméabilité intestinale dans les deux cellules intestinales humaines cultivées ainsi que le modèle nématode C. elegans19.
Dans cette étude, nous avons utilisé trois conditions expérimentales différentes. Tout d’abord, nous avons mesuré les effets des différentes bactéries, P. aeruginosa et E. faecalis, sur la perméabilité intestinale (Figure 1). Deuxièmement, nous avons mesuré les effets de P. aeruginosa vivant et inactivé par la chaleur sur la perméabilité intestinale (Figure 2). Troisièmement, nous avons mesuré les effets du DIM (un modèle chimique) sur la perméabilité intestinale de C. elegans nourris avec P. aeruginosa (Figure 3).
L’objectif de cette étude était de développer des protocoles optimisés qui mesurent la perméabilité intestinale de C. elegans, qui est modifié par le traitement avec diverses bactéries intestinales ainsi qu’avec des produits chimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant cette nouvelle méthode pour déterminer la perméabilité intestinale chez C. elegans, qui combine la microscopie automatisée de fluorescence et l’analyse quantitative d’image, les différences causées par les micro-organismes ou les produits chimiques intestinaux peuvent être déterminées in vivo, spécifiquement dans l’intestin de C. elegans. Ce protocole est utile pour les études de perméabilité intestinale et applicable à de nombreuses tâches, telles que la détermination des …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche intra-muros de l’Institut coréen des sciences et de la technologie (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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