Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse
Summary
Dit artikel presenteert een protocol van differentiële-snelheid centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren te scheiden mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve proteomica analyse, resulterend in een hoge kwaliteit mitochondriale monster en hoge doorvoer en hoge reproduceerbaarheid kwantitatieve proteomica analyse van een menselijke ovariële kanker mitochondriale proteome.
Abstract
Ovariële kanker is een veelvoorkomende gynaecologische kanker met een hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme. De meeste ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de vergevorderd stadium, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Een effectieve mitochondriale bereidingsmethode in combinatie met een isobarische tag voor relatieve en absolute kwantificering (itraq) kwantitatieve proteomica worden hier gepresenteerd om menselijke ovariële kanker te analyseren en mitochondriale proteomes te beheersen, inclusief differentieel toerental centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, itraq-labeling, sterke kationen uitwisselings fractionering (SCx), vloeistofchromatografie (LC), tandem massaspectrometrie (MS/ MS), database-analyse en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Veel eiwitten zijn met succes geïdentificeerd om te maximaliseren van de dekking van de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom en het bereiken van de differentiaal uitgedrukt mitochondriale eiwit profiel in menselijke ovariële kankers.
Introduction
Ovariële kanker is een veel voorkomende gynaecologische kanker met hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme1,2. De meeste van ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de gevorderde fase, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress3,4,5,6,7. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Mitochondriale metabolisme is voorgesteld en erkend als een doelwit voor kankertherapie, en antimitochondrial therapie zou uiteindelijk zeer gunstig zijn voor het voorkomen van de herhaling en metastase van kanker8. Individuele metabole profilering wordt ook al beoefend als een nuttig instrument voor kanker stratificatie en voorspellende strategieën9,10.
Het langetermijndoel van dit onderzoek is het ontwikkelen en gebruiken van een kwantitatieve mitochondriale proteomica-methode om ovariële kanker te bestuderen voor verduidelijking van mitochondriale Proteoom veranderingen tussen eierstokkanker en controle van ovariële weefsels, en hun moleculaire netwerk wijzigingen van een systematische multi-omics hoek11,12, die zal resulteren in de ontdekking van mitochondriën gerichte moleculaire biomarkers13 voor verduidelijking van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, voorspelling en gepersonaliseerde behandeling van ovariële kankerpatiënten. Isobaric-Tags voor relatieve en absolute kwantificering (itraq)-labeling3,4 zijn een effectieve methode om de mitochondriale eiwit veranderingen te kwantificeren. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle ovariële weefsels zijn de voorwaarde voor iTRAQ kwantitatieve analyse van mitochondriale proteomes3. Mitochondriale voorbereiding in combinatie met itraq kwantitatieve proteomica is met succes gebruikt in langetermijnonderzoek Programma’s over de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom, met inbegrip van de oprichting van mitochondriale Proteoom referentiekaarten3, de analyse van differentiaal uitgedrukt mitochondriale profielen4,14 en post-translationele modificaties, met inbegrip van fosforylering, die al heeft geresulteerd in de ontdekking van belangrijke signalering traject netwerkveranderingen in menselijke ovariumkanker5, met inbegrip van veranderingen in het energiemetabolisme4, lipide metabolisme, en mitophagy pathway-systemen3.
Eerdere studies hebben geconstateerd dat het differentieel toerental centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren een effectieve methode is om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke ovariële kanker en controle van ovariële weefsels3,4,5,14. De iTRAQ labeling in combinatie met sterke kation Exchange (SCX)-vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS) is de belangrijkste techniek om te detecteren, identificeren en kwantificeren van de eiwitten uit de voorbereide mitochondriale monsters.
Hier worden gedetailleerde protocollen voor mitochondriale voorbereiding in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomica beschreven. Deze zijn met succes gebruikt in de analyse van menselijke ovariële kanker weefsel mitochondriale proteomes. De protocollen omvatten de bereiding van monsters, differentiële-snelheid centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, iTRAQ-labeling, SCX-fractionering, LC, MS/MS, database zoeken en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Bovendien vertaalt dit Protocol zich gemakkelijk om andere menselijke weefsel mitochondriale proteomes te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van ovariële kanker. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle weefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomica profiteren van de diepgaande kennis van de mitochondriale functie in ovariële kanker pathogenese en mitochondriale moleculaire netwerkveranderingen, en helpen verduidelijken het moleculaire mechanisme voor latere ontdekking van de doelgroep therapie en effectieve biomarkers op basis van mitochondriën<su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het Hunan Provincial Hundred talent plan (to X.Z.), de Xiangya Hospital funds for talent Introduction (to XZ), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 en 81272798 tot XZ), de subsidies uit China “863” plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot en met XZ), en de Hunan Provincial Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 tot XZ). X.Z. bedacht het concept voor het huidige manuscript, verkreeg de itraq kwantitatieve proteomica gegevens van mitochondriën samples, schreef en reviseerde het manuscript, coördineerde het relevante werk en was verantwoordelijk voor de financiële steun en de bijbehorende Werk. H.L. bereide mitochondriën monsters. S.Q. deelgenomen aan gedeeltelijk werk. X. H. Z nam deel aan schriftelijke en bewerkte Engelse taal. N.L. analyseerden de itraq proteomica-gegevens. Alle auteurs keurden het eind manuscript goed.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
Referencias
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
