Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica
Summary
Questo articolo presenta un protocollo di centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità per separare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici per l’analisi proteomica quantitativa, risulta in un campione mitocondriale di alta qualità e un’analisi proteomica quantitativa ad alta capacità di riproduzione e ad alta riproducibilità di un proteoma mitocondriale del cancro ovaricoterrestre umano.
Abstract
Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Un metodo di preparazione mitocondriale efficace accoppiato con un tag isobarico per la quantificazione quantitativa relativa e assoluta (ITRAQ) proteomica quantitativa sono presentati qui per analizzare il cancro ovarico umano e controllare i proteomi mitocondriali, compresa la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con la trippsina, l’etichettatura iTRAQ, la forte frazionazione di scambio di cation (SCX), la cromatografia liquida (LC), la spettrometria di massa tandem (MS/ MS), analisi del database e analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Molte proteine sono state identificate con successo per massimizzare la copertura del proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano e per ottenere il profilo proteico mitocondriale espresso in modo differenziale nei tumori ovarici umani.
Introduction
Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro1,2. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo3,4,5,6,7. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Il metabolismo mitocondriale è stato proposto e riconosciuto come un obiettivo per la terapia del cancro, e la terapia antimitocondriale potrebbe in ultima analisi essere molto utile per prevenire la ricorrenza e la metastasi del cancro8. La profilazione metabolica individuale è già praticata come strumento utile per la stratificazione del cancro e le strategie predittive9,10.
L’obiettivo a lungo termine di questa ricerca è quello di sviluppare e utilizzare un metodo proteomico mitocondriale quantitativo per studiare il cancro ovarico per chiarire le alterazioni del proteoma mitocondriale tra il cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici, e le loro alterazioni della rete molecolare da un angolo multio-omico sistematico11,12, che si tradurrà nella scoperta di biomarcatori molecolari mirati ai mitocondri13 per chiarire i meccanismi molecolari del cancro ovarico, previsione e trattamento personalizzato dei pazienti affetti da cancro ovarico. I tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) che etichettano3,4 sono un metodo efficace per quantificare i cambiamenti delle proteine mitocondriali. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti ovarici di controllo sono il prerequisito per l’analisi quantitativa iTRAQ dei proteomi mitocondriali3. La preparazione mitocondriale abbinata alla proteomica quantitativa iTRAQ è stata utilizzata con successo in programmi di ricerca a lungo termine sul proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano, tra cui l’istituzione di mappe di riferimento proteoma mitocondriali3, l’analisi dei profili mitocondriali espressi in modo differenziale4,14 e modifiche post-traduzionali, compresa la fosforolanazione, che ha già portato alla scoperta di importanti percorsi di segnalazione cambiamenti di rete nei tumori ovarici umani5, comprese le alterazioni del metabolismo energetico4, metabolismo dei lipidi e mitofagia dei sistemi di percorsi3.
Studi precedenti hanno scoperto che la centrifugazione differenziale-velocità in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità è un metodo efficace per isolare e purificare i mitocondri dal cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici3,4,5,14. L’etichettatura iTRAQ abbinata a un forte scambio di cation (SCX)-liquid qromatotry (LC)-tandem mass spectromate (MS/MS) è la tecnica chiave per rilevare, identificare e quantificare le proteine dai campioni mitocondriali preparati.
Qui vengono descritti protocolli dettagliati per la preparazione mitocondriale abbinati a proteomica quantitativa iTRAQ. Questi sono stati utilizzati con successo nell’analisi dei proteomi mitocondriali del tessuto ovarico umano. I protocolli includono la preparazione di campioni, la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con trippsina, l’etichettatura iTRAQ, la frazione SCX, l’LC, la MS/MS, la ricerca nel database e l’analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per analizzare altri proteomi mitocondriali del tessuto umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le alterazioni mitocondriali sono un segno distintivo del cancro ovarico. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti di controllo per la proteomica quantitativa su larga scala beneficia la comprensione approfondita della funzione mitocondriale nella patogenesi del cancro ovarico e nei cambiamenti della rete molecolare mitocondriale e aiuta a chiarire il suo meccanismo molecolare per la successiva scoperta della terapia bersaglio e biomarcatori efficaci basati sui mit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Hunan Provincial Hundred Talent Plan (a X.Z.), Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (a X ) ), la National Natural Science Foundation of China (Grant no. (Grant n. 2014AA020610-1 a X ) e la Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant n. 14JJ7008 a X . X.Z. ha concepito il concetto per il presente manoscritto, ha ottenuto i dati proteomici quantitativi iTRAQ dei campioni di mitocondri, ha scritto e rivisto il manoscritto, ha coordinato l’opera pertinente ed è stato responsabile del sostegno finanziario e dei corrispondenti Lavoro. H.L. ha preparato campioni di mitocondri. S.Q. ha partecipato a lavori parziali. Alla scrittura e alla modifica della lingua inglese, X.H. ha partecipato alla scrittura e alla modifica della lingua inglese. N.L. ha analizzato i dati proteomici iTRAQ. Tutti gli autori hanno approvato il manoscritto finale.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
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