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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Erhöhung der Haltbarkeit dissoziierter neuronaler Zellkulturen unter Verwendung biologisch aktiver Korallenmatrix

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60443
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Ariel University

Summary

Die dissoziierte Hippocampus-Zellkultur ist ein zentrales experimentelles Werkzeug in den Neurowissenschaften. Das Überleben und die Funktion von Nervenzellen in Kultur werden aufgrund ihrer neuroprotektiven und neuromodulativen Rolle verbessert, wenn Korallenskelette als Matrizen verwendet werden. Daher zeigen Nervenzellen, die auf korallenartiger Matrix gezüchtet wurden, eine höhere Haltbarkeit und sind daher besser für die Kultivierung geeignet.

Abstract

Kulturen dissoziierter neuronaler und glialer Zellen im Hippocampus sind ein wertvolles experimentelles Modell zur Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und eine kontrollierte Umgebung bieten. Das Überleben von Hippocampuszellen in vitro ist jedoch gefährdet: Die meisten Zellen sterben in der ersten Woche der Kultivierung ab. Es ist daher von großer Bedeutung, Wege zu finden, um die Haltbarkeit von Nervenzellen in Kultur zu erhöhen.

Calciumcarbonat in Form von kristallinem Aragonit, der aus dem Skelett von Korallen gewonnen wird, kann als überlegene, aktive Matrix für neuronale Kulturen verwendet werden. Durch die Pflege, den Schutz und die Aktivierung von Gliazellen verbessert das Korallenskelett das Überleben und Wachstum dieser Zellen in vitro besser als andere Matrices.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von Hippocampuszellen auf einer korallenartigen Matrix. Diese Matrix wird erzeugt, indem Körner von Korallenskeletten an Kulturschalen, Flaschen und Glasdeckgläsern befestigt werden. Die Körner tragen dazu bei, die Umgebung der Zellen zu verbessern, indem sie sie in eine feine dreidimensionale (3D) Umgebung einführen, in der sie wachsen und gewebeähnliche Strukturen bilden können. Die 3D-Umgebung, die durch das Korallenskelett eingeführt wird, kann durch Schleifen für die Zellen optimiert werden, was die Kontrolle über die Größe und Dichte der Körner (d. h. die Matrixrauheit) ermöglicht, eine Eigenschaft, die nachweislich die Aktivität der Gliazellen beeinflusst. Darüber hinaus erleichtert die Verwendung von Körnern die Beobachtung und Analyse der Kulturen, insbesondere bei der Lichtmikroskopie. Daher enthält das Protokoll Verfahren zur Erzeugung und Optimierung der korallenartigen Matrix als Werkzeug zur Verbesserung der Erhaltung und Funktionalität von Nervenzellen in vitro.

Introduction

Kulturen dissoziierter neuronaler Zellen, in diesem Fall Hippocampuszellen, sind ein wertvolles experimentelles Modell für die Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und -zugänglichkeit bieten 1,2,3. Diese Art von Kultur wird häufig in den Neurowissenschaften, in der Arzneimittelentwicklung und im Tissue Engineering verwendet, da eine große Menge an Informationen gesammelt werden kann, wie z. B. Wachstums- und Lebensfähigkeitsraten, Neurotoxizität, Neuritenwachstum und -vernetzung, synaptische Konnektivität und Plastizität, morphologische Modifikationen, Neuritenorganisation und -verdrahtung usw.1,4,5,6,7.

Trotz der Bedeutung der Kulturen werden die kultivierten Zellen in der Regel gezwungen, auf Glasdeckgläsern in einer zweidimensionalen Monoschicht zu wachsen. Diese strengen Umweltmodifikationen verringern die Überlebensfähigkeit von Nervenzellen im Laufe der Zeit erheblich, da Glasdeckgläser nicht nährende Substrate mit einer geringen Haftfestigkeit sind, die eine geringere Fähigkeit aufweisen, das Zellwachstum zu unterstützen 8,9,10,11.

Da kultivierte Nervenzellen gezwungen sind, unter schwierigen Bedingungen zu wachsen, wäre ein wesentlicher Ansatz, um ihr Überleben zu verbessern, ihre natürliche Umgebung so weit wie möglich zu imitieren12,13. Dies könnte durch die Verwendung von Biomaterialien erreicht werden, die als Matrizen fungieren und die extrazelluläre Matrix der Zellen nachahmen, so dass sie eine gewebeähnliche Struktur bilden und ihre Ernährung unterstützen können14.

Die Verwendung von Biomaterialien ist ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung von Zellkulturen, da sie als biokompatible Gerüste fungieren, mechanische Stabilität bieten und eine Vielzahl von Zelleigenschaften verbessern, darunter Adhäsion, Überleben, Proliferation, Migration, Morphogenese und Differenzierung15,16,17. Verschiedene Arten von Biomaterialien werden verwendet, um die Bedingungen der Zellen in vitro zu verbessern. Dazu gehören Biopolymere, also biologische Komponenten, die in der Regel Teil der extrazellulären Matrix der Zellen sind. Diese Biomaterialien werden meist als Form von polymerisierten Beschichtungsmitteln oder Hydrogelen verwendet18,19,20. Einerseits bieten die oben genannten Matrizen den Zellen eine vertraute 3D-Umgebung, in der sie wachsen können, fördern ihre Adhäsion an der Schale und geben ihnen mechanische Unterstützung21,22. Andererseits stört ihre polymerisierte Form und der Einschluss der Zellen in Hydrogele den Zugang der Zellen zu den in den Wachstumsmedien vorhandenen nährenden Bestandteilen und erschwert auch die Nachverfolgung der Zellen durch mikroskopische Methoden23.

Korallen-Exoskelette sind biologische, aus dem Meer stammende Matrices. Sie bestehen aus Kalziumkarbonat, sind mechanisch stabil und biologisch abbaubar. Frühere Studien, in denen das Korallenskelett als Matrix für das Wachstum von Nervenzellen in Kultur verwendet wurde, haben im Vergleich zu Glasdeckgläsern eine viel größere Haftung gezeigt24,25. Darüber hinaus zeigten Nervenzellen, die auf dem Korallenskelett gezüchtet wurden, ihre Fähigkeit, das Kalzium aufzunehmen, aus dem das Skelett besteht, was die Nervenzellen unter Bedingungen des Nährstoffmangels schützt26. Darüber hinaus ist das Korallenskelett eine unterstützende und nährende Matrix, die das Überleben von Nervenzellen erhöht, die Bildung neuronaler Netzwerke fördert, die Rate der synaptischen Konnektivität erhöht und die Bildung gewebeähnlicher Strukturen ermöglicht27,28. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Oberflächentopographie der Korallenskelettmatrix eine entscheidende Rolle bei der Verteilung und Aktivierung von Gliazellen spielt 8,29. Das Korallenskelett eignet sich auch als Matrix für die Kultivierung anderer Zelltypen wie Osteozyten30, 31, Hepatozyten und Kardiomyozyten in Kultur (unveröffentlichte Daten).

Daher ist das Korallenskelett eine vielversprechende Matrix für die Kultivierung von Zellen in vitro. Daher beschreibt das unten beschriebene Protokoll die Technik der Kultivierung von Nervenzellen auf Korallenskeletten, um stabilere und erfolgreichere neuronale Kulturen zu erzeugen, als dies mit bestehenden Methoden erreicht wird. Dieses Protokoll kann auch für die Kultivierung von Kardiomyozyten, Hepatozyten und anderen Zelltypen nützlich sein.

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Protocol

Die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde vom National Animal Care and Use Committee genehmigt.

HINWEIS: Korallenskelette mit Kalziumkarbonat sollten in der kristallinen Form von Aragonit verwendet werden. Die Korallenarten, die bisher für neuronale Kulturen getestet wurden , sind Porites Lutea, Stylophora Pistillata und Trachyphyllia Geoffroyi. Die Skelette können ganz oder gemahlen gekauft werden.

1. Reinigung der Korallenskelettteile

VORSICHT: Die folgenden Schritte sollten in einer Chemikalienhaube bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da die unten beschriebenen Lösungen gefährlich sind und Verbrennungen und Reizungen verursachen können.

  1. Brechen Sie das Korallenskelett mit einem Hammer auf und teilen Sie es in 0,5–2 cm große Fragmente. Um organische und anorganische Rückstände aufzulösen, weichen Sie die Korallenskelettfragmente 10 Minuten lang in 10%iger Natriumhypochloritlösung ein und waschen Sie sie dann einmal mit doppelt destilliertem Wasser (DDW).
  2. Um die verbleibenden organischen Rückstände zu entfernen, weichen Sie die Fragmente 5 Minuten lang in einer 1M NaOH-Lösung ein und waschen Sie sie dann einmal mit DDW. Fahren Sie mit der Entfernung der organischen Ablagerungen fort, indem Sie die Fragmente 10 Minuten lang in 30%igerH2O2-Lösungeinweichen und die Fragmente dann 3x mit DDW waschen.
  3. Entfernen Sie so viel überschüssiges DDW wie möglich und lassen Sie die Korallenfragmente in der Haube trocknen (1–8 h).

2. Reinigung der Glasdeckgläser

  1. Übertragen Sie die Glasdeckgläser in eine 100 mm Glas-Petrischale. Fügen Sie 10 ml 95%iges Ethanol für 15 Minuten hinzu.
  2. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie es 3x mit DDW, wobei Sie zwischen jedem Waschgang 10 Minuten warten. Stellen Sie die Form auf eine 80 °C vorgewärmte Heizplatte, bis die DDW verdunstet ist. Rühren Sie die Deckgläser während des Trocknens mehrmals vorsichtig um, damit sie nicht aneinander kleben.
  3. Autoklavieren Sie die Deckgläser.

3. Aufbereitung von Korallenskelettkörnern

  1. Mahlen Sie die Korallenskelettfragmente mit einem Mörser und Stößel (manuelles Mahlen), bis sie vollständig zerfallen. Das Ergebnis ist eine Mischung von Körnern mit Größen von 20 μm bis 200 μm.
  2. Alternativ schleifen Sie die Korallenskelettfragmente mit einer elektrischen Schleifmaschine bei einer Geschwindigkeit von 1.000 U/min für 30 s (Klingenlänge = 6 cm; Breite = 0,5 cm–1,0 cm). Die resultierende Korngröße ähnelt dem Größenbereich, der durch die manuelle Vermahlung entsteht.

4. Reinigung von Körnern eines bestimmten Größenbereichs

Anmerkungen: Wenn die Größe der Körner in einer Matrix kontrolliert werden soll, verwenden Sie das folgende filtrationsbasierte Getreidereinigungsverfahren.

  1. Übertragen Sie die Körner auf ein manuelles oder elektrisches 40-μm-Filtersieb.
  2. Teilen Sie die Körner in zwei spezifische Bereiche ein, indem Sie die Körner durch das Sieb sieben (bei Verwendung eines elektrischen Siebs werden die folgenden Bedingungen empfohlen: Schütteln = 600 Amplituden/min, Hüpfen = 6/s). Bei diesem Verfahren werden zwei Gruppen von Korngrößen erzeugt, eine <40 μm und die zweite >40 μm.
    Anmerkungen: Die beiden Größen können mithilfe von Sieben mit unterschiedlichen Maschen bestimmt werden. Wenn ein eingeschränkterer Bereich gewünscht wird, sieben Sie jede Gruppe aus Schritt 4.2 durch Siebe mit unterschiedlichen Maschen erneut.
  3. Autoklavieren Sie die Körner.

5. Zubereitung von mit Korallenkörnern überzogenen Schalen oder Deckgläsern

  1. Zum Beschichten von Kolben, Platten oder Petrischalen
    Anmerkungen: Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
    1. Geben Sie die Korallenskelettkörner in eine 20 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung, die in Hanks' Lösung gelöst ist. Die empfohlene Konzentration beträgt 5 mg/10 mg Getreide pro 1 ml PDL-Lösung.
    2. Die Lösung wird in Kolben und Schalen (ca. 2 ml/25cm2) gefüllt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Körner sinken ab und bleiben am Boden haften.
    3. Waschen Sie am nächsten Tag die Flaschen und das Geschirr einmal mit sterilem DDW. Lassen Sie die Flaschen und das Geschirr in der Haube trocknen.
      Anmerkungen: Es ist vorzuziehen, frisch beschichtete Flaschen und Schalen zu verwenden. Die beschichteten Kolben und Schalen können bis zu einer Woche nach dem Beschichten verwendet werden, wenn sie bei 4 °C aufbewahrt werden. Die Wirksamkeit der Matrix kann jedoch beeinträchtigt werden.
  2. Beschichtung von Glasdeckgläsern (12 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke)
    1. Fügen Sie Korallenskelettkörner in jeder gewünschten Konzentration zu DDW hinzu. Die üblichen Dichten, die für Nervenzellen verwendet werden, sind 5 mg/ml und 10 mg/ml. Gießen Sie 40 μl der Getreidelösung auf die Mitte des Deckglases (Abbildung 4).
    2. Legen Sie die Deckgläser auf eine auf 80 °C vorgewärmte Heizplatte und warten Sie, bis sie vollständig verdunstet sind (in der Regel 15 min). Unter diesen Bedingungen haften die Körner am Deckglas. Autoklavieren Sie die beschichteten Deckgläser. Unter sterilen Bedingungen lagern.
    3. Legen Sie die Deckgläser einen Tag vor der Kultur auf den Deckel einer sterilen 24-Well-Platte. Geben Sie 100 μl 20 μg/ml PDL-Lösung zu jedem Deckglas. Verwenden Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den gesamten Kornbereich und den Rest der Deckglasoberfläche bedeckt.
    4. Decken Sie den Deckel mit dem Boden des Tellers ab. Wickeln Sie die Seiten der Teller mit Paraffinfolie ein. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    5. Am nächsten Tag einmal mit DDW waschen und in der Kapuze trocknen.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frisch beschichtete Deckgläser zu verwenden.

6. Kultivierung von dissoziierten Zellen des Hippocampus auf korallenskelettartigen, kornbeschichteten Glasdeckgläsern

ANMERKUNG: Das Verfahren zur dissoziierten Zellkultur im Hippocampus wurde gegenüber den zuvor veröffentlichten Verfahrenmodifiziert 24,27. Die Präparation der Kultur wird für vier Rattenwelpen beschrieben. Die erwartete Ausbeute jedes Hippocampus beträgt 1–1,5 x 106 Zellen.

  1. Einrichtung
    1. Bereiten Sie eine leere 60-mm-Petrischale vor. Gießen Sie 2 ml minimales essentielles Medium (MEM) in eine 60-mm-Petrischale und legen Sie es auf Eis.
    2. Gießen Sie 2 ml MEM in eine 35-mm-Schale und geben Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C, 5–10 % CO2. Gießen Sie 2 ml MEM in ein 15-ml-Röhrchen und halten Sie es bei 4 °C.
    3. Gießen Sie 1 ml First Day Medium in ein 15-ml-Röhrchen und geben Sie es in einen Inkubator bei 37 °C, 5-10% CO2.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des Ersttagsmediums ist in der Materialtabelle beschrieben.
    4. 200 μl einer 2,5%igen Trypsinlösung auftauen und bei 37 °C inkubieren.
    5. Bereiten Sie drei Pasteurpipetten aus Glas mit Köpfen mit einem Durchmesser von 0,5 mm, 0,75 mm und 1,0 mm mit einer Flamme vor.
    6. Bereiten Sie geeignete chirurgische Werkzeuge vor: eine große Schere, zwei kleine Scheren, eine große Pinzette, vier kleine Pinzetten und ein Skalpell.
    7. Bereiten Sie ein Stereomikroskop in der Haube vor.
  2. Opfern Sie 0–3 Tage alte Sprague-Dawley-Rattenwelpen mit einer großen Schere, indem Sie ihre Köpfe von ihrem Körper in eine leere 60-mm-Petrischale trennen (Schritt 6.1.1). Entsorgen Sie die Leichen.
  3. Heben Sie den Kopf auf, indem Sie ihn mit einer großen Pinzette vom Mund halten. Schneiden Sie die Haut, die den Schädel bedeckt, mit einer kleinen Schere ab.
  4. Gehen Sie mit einer sauberen Schere unter den Schädel (seitlich des Kleinhirns) und schneiden Sie den Schädel rechts und links ab, um ihn entfernen zu können. Ziehe den Schädel mit einer kleinen Pinzette vom Gehirn ab.
  5. Trennen Sie das Gehirn mit einer sauberen Pinzette vom Kopf und geben Sie es in eine 60-mm-Petrischale mit 2 ml kaltem MEM (siehe Schritt 6.1.2).
  6. Sezieren Sie das Nilpferd mit zwei kleinen Pinzetten unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie die Hippocampus in die vorbereitete 35-mm-Schale (aus Schritt 6.1.2), die MEM enthält.
    Anmerkungen: Die Schritte 6.3–6.6 sollten für jeden Welpen wiederholt werden.
  7. Schneiden Sie das Nilpferd mit dem Skalpell in ca. 1 mm dicke Scheiben. 200 μl der Trypsinlösung (verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,25 %) zugeben. Schonend mischen und bei 37 °C, 5–10 % CO2 30 min inkubieren.
  8. Nach der Inkubation werden 2 ml kaltes MEM (Schritt 6.1.2) in die Schale gegeben, um das Trypsin zu deaktivieren. Übertragen Sie das trypsinisierte Gewebe mit der Pasteurpipette aus Glas mit dem größten Durchmesser (Schritt 6.1.5) in ein 15-ml-Röhrchen mit 1 ml First Day Medium, das auf 37 °C vorgewärmt ist (Schritt 6.1.3).
    HINWEIS: Das beste Verhältnis von Medium zu Gewebe (v:v) für die weitere Verarbeitung des Gewebes beträgt 1 ml/8 Hippocampus. Vermeiden Sie es so weit wie möglich, das Medium mit dem Gewebe zu übertragen.
  9. Reiben Sie das Gewebe, indem Sie es 10–15 Mal durch die Glaspipette mit dem größten Durchmesser führen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann mit der Glaspipette mit mittlerem Durchmesser. Setzen Sie das Verreiben mit der Pipette mit dem kleinsten Durchmesser fort. Vermeiden Sie Blasenbildung, um den Zelltod zu reduzieren.
  10. Lassen Sie die restlichen Gewebestücke 2–5 Minuten einsinken und überführen Sie dann den Überstand in ein weiteres 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    HINWEIS: Die bevorzugte Zelldichte beträgt 200.000–400.000 Zellen/ml. Verwenden Sie First Day Medium zum Verdünnen oder Zentrifugieren bei 470 x g , um die Zellen zu konzentrieren.
  11. Säen Sie 100 μl Zellen auf jedes Glasdeckglas. Achten Sie bei der Aussaat darauf, das gesamte Deckglas mit Zellen zu bedecken. Inkubation bei 37 °C, 5–10 % CO2.
  12. Geben Sie am nächsten Tag 500 μl Neuronales Wachstumsmedium in die Vertiefungen.
    HINWEIS: Die Zusammensetzung des neuronalen Wachstumsmediums ist in der Materialtabelle beschrieben.
  13. Legen Sie jedes Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette in die entsprechende Vertiefung, während Sie das First Day Medium durch Kippen des Deckglases entfernen. Saugen Sie das restliche Medium aus dem Deckel.
  14. Inkubation bei 37 °C, 5–10 % CO2. Vermeiden Sie es, das Medium während der Inkubation auszutauschen. Kulturen können unter diesen Bedingungen bis zu 1 Monat gepflegt werden. Die größte Sorge ist die Feuchtigkeit. Achten Sie daher darauf, den Inkubator maximal befeuchtet zu halten.

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Representative Results

Zur Herstellung der Korallenskelettmatrix wurde das gesamte Korallenskelett (Abbildung 1A) mit einem Hammer in 0,5–2 cm große Fragmente zerbrochen (Abbildung 1B) und in drei Schritten (Schritt 1 im Protokoll) mit 10%iger Hypochloritlösung, 1M NaOH-Lösung und 30%igerH2O2-Lösung(Abbildung 1C) gründlich von organischen Rückständen gereinigt. Korallenfragmente wurden gut gereinigt, wenn die Skelettfarbe von braun (Abbildung 1D) zu weiß (Abbildung 1E) wechselte. Anschließend wurden die gereinigten Stücke (Abbildung 2A) entweder mit einem Mörser und Stößel (Abbildung 2B) oder einer elektrischen Schleifmaschine (Abbildung 2C) geschliffen. Beide Verfahren lieferten ähnliche Ergebnisse: eine Mischung von Körnern mit einer Größe zwischen 20 μm und 200 μm (Abbildung 2D-G).

Einer der Vorteile der körnigen Matrix gegenüber löslichen Substraten besteht darin, dass mehrere ihrer strukturellen und physikalischen Eigenschaften modifiziert werden können, wodurch sie quantitativer wird. In dieser Korallenskelett-Kornmatrix wurden zwei der Eigenschaften der Kornmischung manipuliert: die Korngröße und die Korndichte. Um die durch das obige Mahlverfahren erzeugte Größenvielfalt von 20 μm bis 200 μm zu reduzieren, wurde ein Siebansatz mit einem Filtergewebe von 40 μm gewählt. Mit manuellen (Abbildung 3 A–D) oder elektrischen (Abbildung 3E) Sieben wurden zwei Arten von Getreidemischungen hergestellt: eine mit Körnern mit einer Größe von 40 μm bis 200 μm (Abbildung 3 F,H) und die zweite mit einer Größe von 40 μm oder weniger (Abbildung 3G,I). Die Dichte der Körner, die die Deckgläser und Schalen überzogen, wurde einfach durch das Auftragen unterschiedlicher Mengen an Körnern und das Anbringen an den Deckgläsern durch Hitze (Abbildung 4C) oder an Kolben und Schalen durch Schwerkraft (Abbildung 4H) bestimmt. Auf diese Weise wurden Matrizen niedriger (Abbildung 4 D,F,I) und hoher Dichte (Abbildung 4E,G,J) hergestellt.

Abbildung 5 zeigt das Ergebnis der Kultivierung von Hippocampuszellen auf Deckgläsern, die mit <40 μm (10 mg/ml) Korallenskelettkörnern beschichtet sind. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Zellen in Abwesenheit (Abbildung 5A) und Anwesenheit (Abbildung 5B) der Matrix komplexe neuronale Netzwerke bildeten. Die Färbung der Zellkerne (Abbildung 5C,D) zeigte, dass 14 Tage nach der Aussaat die Zelldichte auf der Matrix höher war als auf den unbeschichteten Deckgläsern. Die Färbung mit dem Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) zeigte, dass sich auf der Matrix (Abbildung 5F) im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5E) ein komplexes neuronales und dendritisches Netzwerk bildete. Darüber hinaus erfuhren Gliazellen, die auf der Korallenskelettmatrix gezüchtet wurden und mit dem glialen fibrillären sauren Protein (GFAP) sichtbar gemacht wurden, signifikante morphologische Veränderungen. Sie erhielten mit längeren Fortsätzen ein stacheligeres Aussehen als die auf dem Kontrollsubstrat gewachsenen Gliazellen, wo sie runder und flacher erschienen (Abbildung 5G,H).

Figure 1
Abbildung 1: Reinigung des Korallenskeletts. (A) Das Skelett der Koralle Stylophora pistillata. (B) Zerkleinerte Fragmente des Skeletts vor der Reinigung. (C) Die Fragmente aus (B) nach Behandlung mit Hypochloritlösung, Natriumhydroxid und Wasserstoffperoxid. (D) Vergrößerung des in (B) gezeigten ungereinigten Fragments. (E) Vergrößerung des gereinigten Fragments gemäß (C). Mensur: A = 20 mm; B,C = 10 mm; D,E = 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Zerkleinern des Korallenskeletts. (A) Gereinigte Korallenskelettfragmente. (B) Mörser und Stößel zum manuellen Mahlen. Der rote Pfeil zeigt auf die resultierenden Körner. (C) Schleifmaschine. Der rote Pfeil zeigt auf die resultierenden Körner. (D) Körner nach manuellem Mahlen. (E) Körner nach mechanischem Schleifen. f) Vergrößerung von (d). (G) Vergrößerung von (E). Mensur: A = 15 mm; D,E = 3 mm; F,G = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Kontrolle über die Korngröße. (A-D) Manuelles Abseihverfahren. (A) Verwendung eines 40-μm-Siebs. (B) Sieb mit ungesiebten gemahlenen Körnern, die in ein 50-ml-Röhrchen gegeben und mit einem Wirbel abgeseiht werden. (C) Abgesiebte <40-μm-Körner am Boden des 50-ml-Röhrchens. (D) Körner mit einer minimalen Größe ähnlich der des Gewebes (>40 μm, gelber Pfeil). (E) Mechanisches Sieb zum Abseihen von <40 μm Körnern aus einer Mischung von Körnern mit einer Größe von 20 μm bis 200 μm. (F) Demonstration verschiedener Korngrößen nach dem Mahlen vor dem Abseihen. (G) Demonstration von gespannten Körnern <40 μm. (H) Vergrößerung von (F). (i) Vergrößerung von (G). Skala: F,G = 900 μm; H,I = 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Kontrolle der Dichte der Matrix. (A) Ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit <40 μm Körnern, verdünnt auf 10 mg/ml mit DDW für Deckgläser, PDL für andere Schalen. (B) Glasdeckglas mit 40 μl 10 mg/ml Lösung. (C) Deckgläser mit 40 μl 10 mg/ml-Lösung, die auf einer auf 80 °C vorgewärmten Heizplatte getrocknet werden, damit die Körner am Deckglas haften können. (D) Beschichtetes Deckglas mit einer Kornkonzentration von 5 mg/ml nach DDW-Verdampfung. (E) Beschichtetes Deckglas mit einer Kornkonzentration von 10 mg/ml nach DDW-Verdampfung. f) Vergrößerung von (d). (G) Vergrößerung von (E). (H) Eine 10 mg/ml-Lösung in einem T-25-Kolben, 60-mm-Platte. (I) Beschichteter Kolben mit Körnern in einer Konzentration von 5 mg/ml. J) Beschichteter Kolben mit Körnern in einer Konzentration von 10 mg/ml. Skala: B,D,E,I,J = 3 mm; F,G = 600 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Kultivierung von Nervenzellen des Hippocampus auf der Korallenskelettmatrix. Die Bilder zeigen Zellen, die aus 0–3 Tage alten Rattenjungen-Hippocampus extrahiert wurden, die 14 Tage lang in Kultur gezüchtet und mit GFAP (rot, Gliazellen), MAP2 (grün, neuronale Somen und Dendriten) und DAPI (blau, Zellkerne) gefärbt wurden. (A) Phasenkontrastbild von Zellen in Abwesenheit der Matrix. (B) Phasenkontrastbild von Zellen, die auf der Korallenskelettmatrix gewachsen sind. (C) Zellen, die ohne Matrix gezüchtet wurden und mit DAPI gefärbt sind. (D) Zellen, die auf der mit DAPI gefärbten Korallenskelettmatrix gewachsen sind. (E) Zellen, die in Abwesenheit der für MAP2 gefärbten Matrix gezüchtet wurden. (F) Zellen, die auf der Korallenskelettmatrix gewachsen sind, die für MAP2 gefärbt ist. (G) Zellen, die ohne Matrixfärbung für GFAP gezüchtet wurden. (H) Zellen, die auf der Korallenskelettmatrix gezüchtet wurden, die für GFAP gefärbt wurden. (I) Zusammengefügtes Bild von (C),(E),(G). (J) Zusammengefügte Bild von (D),(F),(H). Skala = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die hier vorgestellte Technik beschreibt einen Weg, um den Erhalt und die Funktionalität von Nervenzellen in Kultur zu verbessern. Dies wird erreicht, indem die Zellen an eine Matrix aus Korallenskelettkörnern geklebt werden, die die Zellen nährt und ihr Wachstum und ihre Aktivität fördert. Die Verwendung dieser Technik erhöht die Fähigkeit des neuronalen Kulturmodells, die Umgebung der Zellen im Gehirn nachzuahmen.

Die Einführung der Matrix als Kultursubstrat hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Substraten, die in klassischen neuralen Zellkulturmethoden verwendet werden. Erstens erhöht es die Zelladhärenz. Die Kombination aus Korallenskelett und PDL erzeugt eine stärkere Haftfähigkeit als Glas und PDL (nicht abgebildet). Es hat sich gezeigt, dass eine solche Erhöhung der Adhäsivität essentiell für das Überleben adhärenter nicht-schwimmender Zellen in Kultur ist32. Zweitens sind die kalziumkarbonisierten Kristalle der Korallenskelettkörner eine Quelle für Kalziumionen, die tatsächlich von den Zellen aufgenommen werden. Es ist sehr wahrscheinlich, dass dies der Grund für die verbesserte Haltbarkeit und erhöhte Dichte (Abbildung 5C,D) der auf der Korallenskelettmatrix gezeigten Nervenzellen ist, verglichen mit ihrem Überlebensniveau in Abwesenheit26.

Ein dritter Vorteil liegt darin, dass die Korallenskelettmatrix im Gegensatz zum Glasdeckglas eigentlich nicht planar ist. Die Körner sind 3D-strukturiert mit einer komplexen, gekrümmten Oberflächenarchitektur. Diese strukturellen Eigenschaften variieren, wenn man bedenkt, dass die Zellen mit Kornpopulationen unterschiedlicher Morphologien, Abmessungen und Dichten konfrontiert sind. Eine solche raue und nicht-planare Kultursubstanz ahmt das Milieu der Zellen in vivo besser nach als das klassische flache Deckglas. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass die Rauheit, Größe und Morphologie des Korallenskeletts die Zellverteilung, das Überleben und die Aktivität der Zellen beeinflusst 8,26,29.

Darüber hinaus unterscheidet sich die 3D-Konfiguration, die eine Korallenskelettmatrix den Zellen als Mikroumgebung bietet, stark von den herkömmlichen Hydrogel-Matrizen, die für das 3D-Wachstum in vitro verwendet werden. Bei der Verwendung von Hydrogelen, wie Kollagen und Hyaluronsäure, sind die Zellen in das Gel23 eingebettet. Das Gel ähnelt der extrazellulären Matrix in Bezug auf Raumfüllung, Steifigkeit und andere Eigenschaften, aber aufgrund der Viskosität der Gele erfordern diese Kulturen komplizierte Fütterungssysteme, um die Zellen gut ernährt zu halten21,22. Im Gegensatz dazu ermöglichen die Korallenskelett-3D-Körner den Zellen, ihre Oberfläche zu besetzen, die für das Nährmedium vollständig offen ist. Darüber hinaus lassen sich die Zellen auf der Korallenskelettmatrix im Gegensatz zu den Hydrogelkulturen leicht durch Phasen- und Fluoreszenzmikroskopie überwachen.

Diese Technik hat mehrere Einschränkungen. Trotz der oben aufgeführten Vorteile ist das Korallenskelett ein Biomaterial und kann nicht hergestellt, sondern aus toten Korallen gesammelt werden, was zu Einschränkungen bei der Matrixversorgung führt, obwohl einige kommerziell erhältlich sind. Auch die Verwendung von Skeletten mehrerer Korallenarten kann zu Variationen in den Kultureigenschaften führen. Auf der anderen Seite eliminiert die Tatsache, dass Korallenskelettkristalle alle aus einer Substanz, Aragonit, bestehen und dass die Größe der Körner kontrolliert werden kann, den größten Teil der chemischen und strukturellen Vielfalt unter den Matrices. Die Körner aller getesteten Biomaterialien sind groß genug, um die Zellen zum dreidimensionalen Wachstum zu zwingen. Die Zellen klettern auf die Körner8, wachsen, indem sie sich an den Spitzen der Kristalle33 anheften und zwischen den Körnern27 kreuzen. Alternativ ist geologischer Aragonit, der aus fossilen Sedimenten und synthetischem Kalziumkarbonat besteht, kommerziell erhältlich und kann als Matrix verwendet werden. Es kann jedoch zu einer geringeren Haftung auf den Glasdeckgläsern kommen.

Im Hinblick auf die Verwendung mehrerer Korallenarten ist es wichtig zu beachten, dass einige Studien Hinweise auf eine Biomineralisation von Korallen gezeigt haben, die zum Vorhandensein verschiedener organischer Ablagerungen zwischen den Kalziumkarbonatkristallen führen kann. Diese können nicht mit dem in diesem Protokoll beschriebenen Reinigungsverfahren33,34 entfernt werden. Diese Tatsache ist von entscheidender Bedeutung bei der Identifizierung eines Biomaterials für biologische Anwendungen. Im Falle dieser Studie wurden zuvor mehrere Schritte durchgeführt, um eine möglichst hohe Homogenität des Gerüsts zu gewährleisten. Zunächst wurden drei Korallenarten auf Matrices getestet: Porites Lutea, Stylophora Pistillata und Trachyphyllia Geoffroyi. Es gab keine signifikanten Veränderungen in Bezug auf Wachstum und Überleben von Nervenzellen auf diesen Korallenskeletten. Dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass unterschiedliche organische Ablagerungen innerhalb des Skeletts in diesem Fall keinen signifikanten Einfluss haben. Zweitens zeigte die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie von sauberen Korallenskeletten das Fehlen organischer Rückstände29.

Es gibt einige kritische Schritte innerhalb des Protokolls, die berücksichtigt werden sollten. Zunächst wird empfohlen, beim manuellen Sieben der Körner das Sieb von Zeit zu Zeit auszutauschen, da die Siebe zum Verstopfen neigen. Das elektrische Sieb wendet beim Sieben mehr Kraft auf. Daher neigt es nicht so leicht zum Verstopfen. Zweitens ist es wichtig, beim Verteilen der PDL-Korallenkornmischung auf dem Geschirr und den Deckgläsern die Mischung häufig zu pipettieren, um ein Absinken der Körner zu vermeiden. Dadurch wird eine homogene Dispergierung der Lösung gewährleistet. Es ist wichtig, auf den Anbringungsprozess der Körner an den Deckgläsern zu achten. Falsche Heiztemperaturen während der Kornbefestigung am Glasdeckglas, Vibrationen und andere Faktoren können dazu führen, dass sich die Körner vor oder nach der Zellaussaat lösen. Es wird empfohlen, dieses Problem zu lösen, indem die Temperatur sorgfältig kontrolliert und Vibrationen minimiert werden. Darüber hinaus ist es vorzuziehen, die Experimente zu einem festgelegten Zeitpunkt nach dem Beschichten der Kolben und des Geschirrs durchzuführen. Wir empfehlen, das Geschirr einen Tag vor der Kultur frisch zu bestreichen. Eine längere Inkubation von Schalen mit der PDL-Getreidemischung kann zu einer Diversität in der Menge der an die Schale gebundenen Körner führen.

Einige Modifikationen der oben beschriebenen Technik sind je nach den Bedürfnissen der kultivierten Zellen möglich. Zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, das Wachstum von Nervenzellen in Kultur zu verbessern, unterstützen Korallenskelettmatrizen das Wachstum von Osteozyten30,31, Hepatozyten und Kardiomyozyten (unveröffentlichte Daten). Um die Haltbarkeit anderer Zelltypen zu erhöhen, wird empfohlen, die stärkste Zellreaktion auf Skelette verschiedener Korallenarten zu überprüfen und die Größe und Dichte der Körner zu optimieren.

Es ist auch möglich, Nervenzellen direkt auf den Körnern zu züchten, ohne zusätzliche Beschichtung. Die Vorbeschichtung der Körner mit PDL, wie sie in diesem Protokoll (Schritt 5) erwähnt wird, verbessert jedoch die Adhäsion und das Überleben der Nervenzellen erheblich, und zwar oberhalb der Werte, die mit PDL-beschichtetem Glas erzielt werden. Es ist auch möglich, andere Beschichtungsmaterialien zu verwenden, je nach Präferenz verschiedener Zelltypen.

Es ist erwähnenswert, dass die Größe der Körner in der Matrix begrenzt ist. Ab einem bestimmten Schwellenwert, etwa 200 μm, wird es schwierig, sie an die Glasdeckgläser zu binden. Daher hat die Rauheit der Matrixoberfläche einen endlichen Bereich. Experimente, die größere Körner oder Skelettstücke erfordern, sind für diese Technik nicht geeignet. Man kann einen alternativen Weg finden, um größere Körner anzubringen, vielleicht mit Klebstoffen oder Gelen, aber das kann den Zellkontakt mit den Körnern verdecken. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Zellen direkt auf dem Skelett zu kultivieren, ohne sie zu zermahlen. Diese Methode erfordert eine Modifikation des Zellseeding-Verfahrens24,27. Die 3D-Struktur des nicht geschliffenen Korallenskeletts trägt zum Überleben der Nervenzellen bei, wie wir bereits berichtet haben26. Eine derart komplexe und dichte Matrix erschwert jedoch die Arbeit mit der Mikroskopie. Der kompromittierte Aufbau des gemahlenen Skeletts bewahrt die chemischen Eigenschaften des Skeletts, ermöglicht eine 2D-Mikroskopie-Analyse und zwingt die Zellen aufgrund der Größe der Körner dazu, in 3D8 zu wachsen.

Darüber hinaus kann ein Überschuss an Korallenskelettkörnern giftig sein. Wie oben erwähnt, wird die Kalziumkomponente der Korallenskelettmatrix von den Zellen35 absorbiert. Ein Kalziumüberschuss, der durch eine hohe Korndichte verursacht wird, kann für einige Zelltypen eine Belastung darstellen oder sogar hemmend sein, wie im Fall von Nervenzellen36. Daher kann für jeden Zelltyp eine Reduzierung der Korndichte erforderlich und optimiert werden. Darüber hinaus ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Verfügbarkeit von Korallenskeletten begrenzt sein kann. Korallen wachsen langsam in Aquarien und in ihrer natürlichen Umgebung. Ihr Wachstum wird durch die globale Erwärmung und die Versauerung der Ozeane weiter gehemmt37. Daher sind die Häufigkeit und Verfügbarkeit von Korallenskeletten begrenzt.

Die Stärkung der dissoziierten Nervenzellen bei Kontakt mit Korallenskelettkörnern in Kultur eröffnet neue Wege für die Forschung in der Neurobiologie. Zellwachstum, neuritische Ausdehnung und Verzweigung sowie Synaptogenese und synaptische Plastizität können mit erhöhter Intensität und längerer experimenteller Dauer untersucht werden.

Es scheint auch, dass die korallenartige Matrix eine Zunahme einiger zellulärer Funktionen der Gliazellen wie Wachstum, Reaktivität und Proliferation verursacht. Es ist daher möglich, dass diese Bedingungen auch die astrozytäre Fähigkeit erhöhen, die dissoziierten neuronalen Nährmedien mit sezernierten trophischen Faktoren anzureichern, was für die regenerative Medizin des zentralen Nervensystems von Bedeutung sein könnte.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das KAMIN-Programm des israelischen Handels- und Arbeitsministeriums und durch Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA, finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Greiner #60-662160
B-27 Gibco #17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma #A4503
D – glucose Sigma #G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) Sigma #D5796
Electrical sieve Ari Levy #3700
Fetal Bovine Serun (FBS) Biological Industries #04-007-1A
First Day Medium 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks Greiner #60-690160 25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine Sigma #F0503
Glass Coverslips Menzel-Glaser #BNCB00120RA1
H2O2 Romical #007130-72-19 Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture Sigma #N4888
HANK'S solution Sigma #H6648
Kynurenic acid Sigma #K3375
L - glutamine Sigma #G7513
Manual strainer (40µm) VWR #10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM) Sigma #M2279
Mortar and pestle De-Groot 4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite) Sigma #425044 Hazardous
NaOH Sigma #S8045 Hazardous
Neuronal Growth Medium 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish Greiner #60-628160, #60-627160 60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine Sigma #P7280
Smart Dentin Grinder KometaBio #GR101
Trypsin Gibco #15-090-046
Uridine Sigma #U3750

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Weiss, O. E., Hendler, R. M., Baranes, D. Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix. J. Vis. Exp. (160), e60443, doi:10.3791/60443 (2020).

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