בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.
Abstract
מספר פרוטוקולים דווחו בספרות על הבידוד והתרבות של תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC). עם זאת, אלה להניח כי האפיתל השפיר היא שכבה הומוגנית. ניתן לחלק את השפיר האנושית לשלושה אזורים אנטומיים: השתקפות, הפלפה והטבור. לכל אזור יש תפקידים פיזיולוגיים שונים, כמו בתנאים פתולוגיים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את. הרקמה האנושית בשלוש מחלקות ולתחזק אותה בתרבות, תאים שמקורם בשפיר משתקף על הציגו מורפולוגיה בוטאידית, בעוד תאים משני האזורים ואזורי הטבור היו קשקשיים. עם זאת, כל התאים המתקבלים יש פנוטיפ אפיתל, הפגינו על ידי זיהוי חיסוני של E-קדהרין. לפיכך, מכיוון שהאזורים השונים והמשתקפים באתרו שונים ברכיבים סלולריים ובתפקודים מולקולריים, ייתכן שיהיה צורך בלימודי מבחנה כדי לשקול הבדלים אלה, משום שיכולים להיות להם השלכות פיזיולוגיות לשימוש ב-haec ב מחקר ביו ויישום מבטיח של תאים אלה ברפואה רגנרטיבית.
Introduction
תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC) מקורם בשלבים המוקדמים של התפתחות עובריים, בסביבות שמונה ימים הפריה. הם נובעים מאוכלוסייה של תאים אפיתל הקשקש של אפיפיצוץ שנובעים השכבה הפנימית ביותר של קרום השפיר1. כך, HAEC נחשבים שאריות של תאים בעלי עוצמה מאפיפיצוץ כי יש פוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט של העובר2. בעשור האחרון פיתחו קבוצות מחקר מגוונות שיטות לבידוד תאים אלה מקרום השפיר בתקופת ההיריון על מנת לאפיין את המאפיינים הקשורים לשוערת פלאוריאון שלהם במודל תרבות מחוץ לתחום3,4.
בהתאם, הוא נמצא כי התכונות התכונות HAEC מאפיין של תאי גזע האדם pluriפוטנטי (HPSC), כגון אנטיגנים פני השטח SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; הליבה של מרכיבי תמלול שעתוק OCT4, SOX2, ו-NANOG; ומסמן ההתפשטות KI67, הרומז שהם מחדשים את עצמם5,6,7. יתר על כן, תאים אלה כבר מאותגרים באמצעות פרוטוקולי בידול להשיג תאים חיוביים עבור סמנים ספציפיים שושלת היוחסין של שלוש שכבות הנבט (העור, מזועור, ואנדועור)4,5,8, כמו גם במודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות. לבסוף, haec אקספרס E-קדהרין, אשר מדגימים כי הם שומרים על טבע אפיתל בדיוק כמו hsc5,9.
מלבד המוצא העובריים, haec יש תכונות פנימיות אחרות העושות אותם מתאים ליישומים קליניים שונים, כגון הפרשה של מולקולות אנטי דלקתיות ו-אנטיבקטריאלי10,11, גורמי גדילה ושחרור ציטוקינים12, אין היווצרות של teratomas כאשר הם מושתלים לתוך עכברים לקויה בניגוד עם hpsc2, ואת הסובלנות החיסונית כי הם לבטא hla-G, אשר מקטין את הסיכון של דחייה לאחר השתלת13.
עם זאת, הדיווחים הקודמים הניחו כי המין האנושי הוא קרום הומוגנית, מבלי להתחשב בכך שהוא יכול להיות מחולק מבחינה אנטומית ופיזיולוגית לשלושה אזורים: משטחי השפיר המכסים את הדציבלים, הטבור (החלק שעוטף את חבל הטבור), ומשתקף (שאר הקרום אינו מוצמד לשליה)14. הוכח כי האזורים המשחיים ומשתקפים של השפיר על הבדלים בתצוגה מורפולוגיה, פעילות מיטוכונדריאלי, זיהוי של מינים חמצן תגובתי15, mirna ביטוי16, והפעלה של מסלולים איתות17. תוצאות אלה מרמזות על כך שהשפיר האנושי משולב על ידי אוכלוסיה הטרוגנית עם פונקציונליות שונה שיש להתייחס אליה למחקרים נוספים שבוצעו בתוך מודלים מחוץ לבית או במודלים של מבחנה. בעוד מעבדות אחרות עיצבו פרוטוקולים לבידוד של HAEC מהקרום כולו, המעבדה שלנו הקימה פרוטוקול לבידוד, תרבות, ואפיון תאים מאזורים אנטומיים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מיושמים פרוטוקול חדש כדי לבודד HAEC מקרום המונח. הוא שונה מדיווחים קודמים בכך שכל ממברנה חולקה לשלושת האזורים האנטומיים שלה לפני בידוד כדי לנתח תאים מכל אחד מהם.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא רחיצת הקרום כדי להסיר את כל קרישי הדם, כי הם יכולים להפריע לפעילות של ט…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שלנו נתמך על ידי מענקים ממכון הלאומי לחקר הנאסיונאל דה מקסיקו (21041 ו-21081) ו-CONACYT (A1-S-8450 ו-252756). אנו מודים לג גונזלס נוריס ו לידיה יוריה Paredes Vivas לתמיכה טכנית.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
Referencias
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
