JoVE Journal > Immunology and Infection
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Inmunología y contagio

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

Published: February 20, 2020
doi:
10.3791/60617
, , , ,
1Department of Physiology, Institute of Bioscience,University of Sao Paulo

Summary

여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.

Abstract

Leishmania 종은 leishmaniases, 내장 병변에 절단에서 임상 표현의 넓은 스펙트럼을 제시하는 질병을 일으키는 원인이 되는 원생 동물 기생충입니다. 현재, 1,200만 명의 사람들이 전 세계적으로 Leishmania에 감염되고 10억 명 이상이 감염의 위험에 살고 있는 것으로 추정됩니다. 리슈마니아 아마존은 중남미에서 발병하며 일반적으로 동물 모델에서 직접 시각화 할 수있는 질병의 절단 형태로 이어집니다. 따라서, L. amazonensis 균주는 또한 쉽게 시험관내에서 재배되기 때문에 종족 리슈만편모충증 연구를 위한 좋은 모델이다. C57BL/6 마우스는 인간에서 관찰된 L. amazonensis-구동질병 진행을 모방하고 절단 성 리슈만편모충증을 위한 제일 마우스 긴장 모형의 한개로 여겨집니다. 척추 동물 숙주에서, 이 기생충은 이 세포의 방어 기계장치에도 불구하고 대식세포에 서식합니다. 몇몇 연구 결과는 다른 조건의 기생충 감염을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 반응을 이용합니다. 그러나, 시험관내 접근법은 유기체의 반응을 무시하는 단리된 세포 시스템으로 제한된다. 여기서, 우리는 숙주-기생충 상호작용의 전신 생리학적 개요를 제공하는 생체 내 뮤린 감염 방법을 컴파일한다. L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염을 위한 상세한 프로토콜은 감염성 amastigotes, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 결정으로 기생충 분화를 포함합니다. 우리는 이 잘 확립된 방법을 종피 리슈만편모충증에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구를 위한 가장 적절한 방법으로 제안합니다.

Introduction

리슈마니아제는 개발도상국에서 중요한 과제를 나타내는 세계적으로 널리 퍼진 기생 전염병이며세계보건기구(WHO)에 의해 가장 중요한 소홀히 한 열대성 질병 중 하나로 인정받고있다. 리슈만편모충증은 상처, 점막 및/또는 내장 증상이 특징입니다. 절단 성 리슈만편모충증은 일반적으로 L. amazonensis, L. 멕시코, L. 브라질리아엔시스, L. guyanensis, L. major, L. 트로피카 및 L. aethiopica3에기인합니다. 이 형태의 질병은 종종 보호 세포 면역 반응의 유도로 인해 인간에서 자가 치유됩니다. 그러나, 세포 면역 반응이 실패할 수 있고, 질병은 종족 리슈만편모충증4,5를전파하기 위하여 진행될 수 있다. 리슈마니아 종과 호스트 유전적 배경 중 다양성으로 인해 사용 가능한 백신이 없습니다6,7. 치료 옵션은 또한 현재 사용 가능한 약물의 대부분이 비싸고 독성이 있거나 장기 치료가 필요할 수 있기 때문에 제한됩니다8,9. 게다가, 사용 가능한 치료에 대한 약물 내성의 보고가 있었다10,11.

리슈만편모충증의 원인인 것은 원생동물 기생충 리슈마니아이다. 기생충은 그것의 생활 주기에 있는 2개의 명백한 형태학적인 양식을 제출합니다: promastigotes, 모래파리에서 찾아낸 깃발 모양; 및 아마티고테스, 포유류 숙주 대식세포12,13의기생충 성 액수올에서 발견되는 세포내 형태. 척추동물 숙주들의 대식세포의 방어 기전에도 불구하고 침략, 생존 및 복제하는 Amastigotes의 능력은 많은 연구의 대상이 된다14,15,16,17. 따라서, 몇몇 연구 단은 기생충 감염에 특정 환경 요인의 충격을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 분석, 뿐만 아니라 기생충 및 호스트 유전자를 기술하고 있습니다. 이 분석은 연구를 높은 처리량 형식으로 적응하는 능력, 결과를 얻기 위해 비교적 짧은 기간, 및 희생된 실험실 동물의 감소수(18)와같은 몇 가지 장점을 제시한다. 그러나, 시험관내 시험관내 비고법의 발견은 항상 생체내 연구에서 복제되지 않기 때문에 제한적이다14,19,20,21. 생체 외 에서 시험관 내 애시스에 의해 완전히 모방 될 수 없는 호스트 기생충 상호 작용의 조직 생리적 개요를 제공 합니다. 예를 들어, 면역학적 연구는 수집된 풋패드 조직 섹션으로부터의 면역조직화학 분석또는 회복된 면역세포의 분석을 위한 포물성 림프절로부터의 면역조직화학분석(22)을 통해 수행될 수 있다.

동물은 종종 질병의 근본적인 생리적 기전을 더 잘 이해하기 위해 생물학적 및 생물의학 연구에서 인간 질병에 대한 모델로사용된다(23). 리슈만편모충증의 경우, 접종의 경로, 부위 또는 투여량이 질병 결과24,25,26,27에영향을 미친다. 더욱이, 인간과 마우스의 감염에 대한 감수성과 저항성은 숙주 및 기생충4,5,22,28,29,30,31의유전적 배경에 의해 매우 조절된다. BALB/c 마우스는 L. amazonensis 절단 감염에 매우 민감하며, 림프절, 비장 및 간32에기생충의 보급과 함께 급속한 질병 진행을 나타낸다. 질병이 절단 전이에 점진할 수 있기 때문에, 감염은 치명적일 수 있습니다. 대조적으로, C57BL/6 마우스는 L. amazonensis 감염 asays33에있는 지속적인 기생충 부전을 가진 만성 병변을 수시로 개발합니다. 이에 따라, L. amazonensis 감염은 BALB/c 마우스 감염 모델5,34보다질병 진행을 더 잘 모방하기 때문에 인간에서 만성 형태의 종족 리슈만편모충증을 연구하는 훌륭한 모델로 간주되고 있다.

따라서, 우리는 생체 내 뮤린 감염이 인간 질병에 적용 가능한 리슈마니아 바이러스 성 생리학적 연구에 유용한 방법이며, 숙주 기생충 상호 작용의 전신 보기를 허용하는 것을 제안한다. 잘 확립된분석22를다시 방문하면, 우리는 여기에 암기생충 분화를 포함하는 L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염의 컴파일된 단계별 프로토콜을 제시하고, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 측정. 이 프로토콜은 다른 마우스 균주 및 리슈마니아 종에 적응될 수 있으며 이는 종족의 리슈만편모충증을 유발한다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 새로운 항리슈마니아 약물 표적 및 백신을 식별하는 데 중요하며, 리슈마니아 감염에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구에서도 중요하다.

Protocol

모든 실험 절차는 상파울루 대학 생명 과학 연구소의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며(CEUA 342/2019), 상파울루 주의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 권장 사항 및 정책에 따라 수행되었습니다(Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) 및 브라질 정부 (레이 연방 11.794, 드 08/10/2008). 섹션 1-5에 설명된 모든 단계는 층류 캐비닛 내부에 무균 적으로 수행되어야한다. 살아있는 리슈마니아 기생충을 ?…

Representative Results

Leishmania 원생 동물 기생충은 무척추 동물과 척추 동물 숙주에서 수명 주기 동안 두 가지 발달 형태로 존재합니다 : 무도회, 여성 모래의 내원에서 발견되는 증식 형태; 및 암스티고테스, 포유류 숙주 세포의 기생충 기피액에서 발견되는 증식형태. Promastigotes는 대략 1.5 μm 넓이 및 20 μm 길이의 길쭉한 바디가 있고, 전형적으로 전방 사지에서 나오는 편모와. 아마스티?…

Discussion

이 프로토콜에 기재된 생체 내 감염 분석법은 모든 연구원이 전신 시나리오에서 숙주 기생충 상호작용을 고려하여 생체 내 종족 근동성 편동증을 평가할 수 있게 한다. 이러한 분석법은 많은 그룹22,24,29,31,32,34,<sup…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

상파울루 대학교 생물의학 연구소의 동물 센터의 닐스 올슨 사라이바 카마라 교수님의 지원과 실비아 레니 울리아나 교수님에게 유리 조직 분쇄기를 제공한 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 상파울루 연구 재단에 의해 지원되었다 (FAPESP – MFLS의 보조금 2017/23933-3).

Materials

96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension
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Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).
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