Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet
Summary
Dieses Protokoll demonstriert die genaue und reproduzierbare Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Pankreasinseln. Die Beladetechniken der Isleten und die Beschichtung der Mikroplatte bieten einen Rahmen für eine effiziente Messung der Atmung in anderen Arten von kultivierten Sphäroiden.
Abstract
Die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroid-Clustern von Zellen, wie ex vivo Pankreasinseln, war historisch eine Herausforderung. Wir demonstrieren die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Islet enmitieren mit einer 96-Well-Mikroplatte, die für die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroiden entwickelt wurde. In diesem Test werden Sphäroid-Mikroplatten am Tag vor dem Test mit einem Zell- und Gewebekleber beschichtet. Wir verwenden ein kleines Volumen an Klebstofflösung, um die Befolgung der Leten nur an der Unterseite des Brunnens zu fördern. Am Tag des Assays werden 15 Inselchen mit einer Technik, die eine optimale Positionierung der Inselchen und eine genaue Messung des Sauerstoffverbrauchs gewährleistet, direkt in die Basis jedes Brunnens geladen. Verschiedene Aspekte der mitochondrialen Atmung werden pharmakologisch in nichtmenschlichen Primateninseln untersucht, einschließlich ATP-abhängiger Atmung, maximaler Atmung und Protonenleck. Diese Methode ermöglicht konsistente, reproduzierbare Ergebnisse mit nur einer kleinen Anzahl von Inselchen pro Bohrplatz. Es kann theoretisch auf alle kultivierten Sphäroide ähnlicher Größe angewendet werden.
Introduction
Um den normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten, muss die Pankreas-Zelle Erhöhungen in Glukose spüren und Insulin entsprechend absondern. Die Kopplung der Insulinsekretion mit dem Glukosespiegel ist direkt mit dem Glukosestoffwechsel und der Produktion von ATP durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung verbunden. Daher spielen Mitochondrien eine entscheidende Rolle bei der Stimulus-Sekretionskopplung1. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion der Zelle kann Defekte aufdecken, die zu einer beeinträchtigten Insulinsekretion führen. Die Sekretion von Glucagon durch Pankreaszellen ist ebenfalls eng mit der mitochondrialen Funktion2verbunden. Obwohl sich verewigte Inselzelllinien für einige Arten von Assays als nützlich erwiesen haben, rekapituliert die Physiologie dieser Zellen die Funktion der ganzen Insel inselnicht genau, wie die Potenzierung der Insulinsekretion durch Glucagon3,4 und die Hemmung der Glucagonsekretion durch Insulin/Somatostatin5,6 in intakten Inselchen zeigt. Dies zeigt die Notwendigkeit, den Sauerstoffverbrauch mit ganzen, intakten Inseln zu messen.
Techniken zur Messung der Isletzell-Respirometrie haben sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt, von der Verwendung von sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen7 bis hin zu Festkörpersensoren, die den Sauerstoffverbrauch direkt messen8. Ursprünglich für monolayer, haftende Zellen entwickelt, haben sich häufig verwendete Zellkulturplattensysteme als unwirksam für Pankreasinseln erwiesen. Da Inselchen nicht natürlich an den Brunnen haften, neigen sie dazu, an die Peripherie der Kultur brunnen geschoben zu werden, was zu einer ungenauen Messung des Sauerstoffverbrauchs9führt. Um dieses Problem zu bekämpfen, wurden spezialisierte 24-Well-Platten mit einer zentralen Depression entwickelt, die Inselchen enthalten könnte9. Das 24-Well-Plattensystem wurde jedoch durch die große Anzahl der benötigten Inseln (50-80 pro Brunnen) und die Anzahl der Bedingungen, die gleichzeitig getestet werden konnten,10begrenzt. Die jüngste Entwicklung von 96-Well-Mikroplatten, die speziell für die extrazelluläre Flussflussanalyse in Sphäroiden entwickelt wurden, hat diese Barrieren überwunden und ermöglicht die Messung der Inselrespirometrie mit 20 oder weniger Inselchen pro Brunnen10.
Hier zeigen wir die Verwendung dieses Systems zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Inselchen aus dem japanischen Makaken (Macaca fuscata), einem Tiermodell mit ähnlicher Inselbiologie wie Menschen11,12. In diesem Protokoll werden 15 Makakeninseln pro Brunnen analysiert. In unseren Händen produzierten 15 Inseln pro Brunnen einen höheren Ausgangssauerstoffverbrauch als weniger Inseln, mit robuster Aktivierung und Unterdrückung der Atmung als Reaktion auf pharmakologische Manipulation. Wir heben die Schritte zur Vorbereitung auf den Assay hervor, eine effektive Methode für das konsistente Laden von Inselchen in der Mitte jedes Brunnens und gemeinsame Herausforderungen bei der Durchführung dieses Assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs der Insel wurde bisher durch die kugelförmige Form von Inselchen, deren mangelnde Haftung an Kulturoberflächen und die Anzahl der pro Brunnen benötigten Inselchen behindert. In diesem Protokoll unterstreichen wir die Wirksamkeit der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Inselchen auf einer kleinen Anzahl von Inselchen und zeigen eine Technisch machbare und konsistente Technik zum Um- und Laden von Inselchen Ergebnisse.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Vanderbilt High Throughput Screening Core für die Nutzung ihrer Einrichtungen, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) für nichtmenschliche Primaten-Islet-Isolierungen und Eric Donahue (Vanderbilt University) für die Unterstützung von Abbildung 1 würdigen. J.M.E. wurde von NIGMS der National Institutes of Health unter der AuszeichnungT32GM007347 unterstützt. M.G. wurde vom NIH/NIDDK (R24DK090964-06) und dem Department of Veterans Affairs (BX003744) unterstützt.
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
Referencias
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