ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

Snehadri Sinha; Bettina Mannerström; Riitta Seppänen-Kaijansinkko; Sippy Kaur

doi:10.3791/60705

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Artículo de método

ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

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DOI:

10.3791/60705

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1 de febrero de 2020

Snehadri Sinha^*¹^,² , Bettina Mannerström^*¹^,² , Riitta Seppänen-Kaijansinkko¹^,² , Sippy Kaur¹^,²

¹Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, ²Helsinki University Hospital

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se describe el uso de un método de amplificación de sonda específico para metilación para analizar los niveles de metilación de los elementos LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma. También se demuestra la ultracentrifugación, un procedimiento popular para separar vesículas extracelulares del suero bovino fetal.

Resumen

La amplificación de sonda específica de metilación (MSPA) es una técnica simple y robusta que se puede utilizar para detectar diferencias relativas en los niveles de metilación de las muestras de ADN. Es ingenioso, requiere pequeñas cantidades de ADN y toma alrededor de 4-5 h de trabajo práctico. En la técnica presentada, las muestras de ADN se desnaturalizan primero y luego se hibridan a sondas que apuntan al ADN en sitios metilados o de referencia como control. El ADN hibridado se separa en reacciones paralelas, una sometida únicamente a la ligadura y la otra sometida a ligadura seguida de la digestión mediada por HhaI en secuencias GCGC no metiladas. Los fragmentos de ADN resultantes son amplificados por PCR y separados por electroforesis capilar. Los sitios de GCGC metilados no son digeridos por HhaI y producen señales máximas, mientras que los sitios GCGC no metilados se digieren y no se generan señales máximas. La comparación de los picos normalizados de control de las versiones digeridas y no digeridas de cada muestra proporciona la relación de dosificación de metilación de una muestra de ADN. Aquí, MSPA se utiliza para detectar los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (EV) en el estado de metilación del elemento nuclear intercalado largo-1 (LINE-1) en células madre mesenquimales. Los LINE-1 son elementos repetitivos del ADN que normalmente sufren hipometilación en el cáncer y, en esta capacidad, pueden servir como biomarcadores. La ultracentrifugación también se utiliza como método rentable para separar las vesículas extracelulares de los fluidos biológicos (es decir, al preparar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] y aislar los vehículos eléctricos de los medios condicionados por osteosarcoma [centrifugación diferencial]). Para el análisis de metilación, las sondas line-1 personalizadas están diseñadas para dirigirse a tres sitios de metilación en la secuencia de promotor es tinoya y siete sitios de control. Este protocolo demuestra el uso de MSPA para el análisis de metilación LINE-1 y describe la preparación de FBS agotado por EV por ultracentrifugación.

Introducción

La metilación del ADN es una modificación epigenética importante que se produce en las células humanas. La metilación del ADN se refiere a la vinculación de los grupos metilo con los residuos de citosina en los dinucleótidos de CpG. Estos dinucleótidos se encuentran generalmente en grupos (islas CpG) en la región de 5' de genes¹. En las células normales, la mayoría de estos dinucleótidos existen en un estado no metilado, lo que permite la transcripción del ADN. Por cierto, muchos cánceres se asocian con islas de CpG hipermetiladas y silenciamiento transcriptomo^2,especialmente en genes supresores de tumores, que a su vez ....