Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten
Summary
Für multipleX-Immunostaining mit primärer Antikörper aus der gleichen Wirtsart wurden verschiedene Methoden etabliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Mikrowellen-vermittelten Antikörper-Stripping und von Fluorophor-Tyramid, um Antikörper-Kreuzreaktivität während multiplex-immunostaining auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Mausnebennierenabschnitten zu blockieren.
Abstract
Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um die zelluläre Expression Muster eines bestimmten Proteins zu zeigen. Multiplex-Immunostainierung ermöglicht die Etikettierung mit mehreren primären Antikörpern. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität zu minimieren, erfordert multiplexe Immunfärbung mit indirekter Färbung unbeschriftete Primärantikörper verschiedener Wirtsarten. Die geeignete Kombination verschiedener Artenantikörper ist jedoch nicht immer verfügbar. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung unbeschrifteter Primärantikörper derselben Wirtsart (z.B. in diesem Fall stammen beide Antikörper von Kaninchen) zur Multiplex-Immunfluoreszenz auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten. Bei dieser Methode wird das gleiche Verfahren und die gleichen Reagenzien verwendet, die im Antigen-Retrieval-Schritt verwendet werden, um die Aktivität des zuvor gebeizten Primärantikörperkomplexes zu entfernen. Die Dias wurden mit dem ersten primären Antikörper mit einem allgemeinen Immunfleckenprotokoll befleckt, gefolgt von einem Bindungsschritt mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Dann wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Signalentwicklungsmethode mit Fluorophor-Tyramid als Substrat verwendet. Die Immunaktivität des ersten primären Antikörperkomplexes wurde durch Eintauchen in eine Mikrowellen-Koch-Natriumcitratlösung für 8 min abgestreift. Die unlösliche Fluorophor-Tyramid-Ablagerung blieb auf der Probe, wodurch der Schlitten mit anderen primären Antikörpern gefärbt werden konnte. Obwohl diese Methode die meisten falsch positiven Signale eliminiert, kann ein gewisser Hintergrund von Antikörper-Cross-Reaktivität bleiben. Wenn die Proben mit endogenem Biotin angereichert sind, kann ein peroxidasekonjugierter Sekundärantikörper verwendet werden, um den biotinylierten Sekundärantikörper zu ersetzen, um das falsche Positiv aus wiedergewonnenem endogenem Biotin zu vermeiden.
Introduction
Bei multipleximmunostaining kann die direkte Färbung mit konjugierten Primärantikörpern informative Ergebnisse liefern. Ohne sekundäre Antikörper hat die direkte Färbemethode ein geringes Risiko für falsche Kolokalisierungssignale durch Antikörper-Kreuzreaktivität. Die konjugierten Reporter (Fluorophor, Enzyme) oder Biotin auf dem primären Antikörper begrenzen jedoch seine zukünftige Verwendung. Alternativ liefert die indirekte Immunfärbung in der Regel stärkere Signale, indem ein nicht konjugierter Primärantikörper mit einem markierten sekundären Antikörper verwendet wird. Idealerweise sollten nicht konjugierte primäre Antikörper, die in Multiplex-Immunostainierung verwendet werden, von verschiedenen Wirtsarten stammen, um Antikörper-Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die geeignete Kombination von Primärantikörpern verschiedener Wirtsarten ist jedoch nicht immer verfügbar.
Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um das Risiko zu beseitigen, dass der sekundäre Antikörper mit einem unerwünschten primärantikörper reagiert. Eine gängige Methode ist die Verwendung eines monomeren F(ab) Antikörpers, um alle verbleibenden Bindungsepitope auf dem ersten primären Antikörperkomplex zu blockieren, bevor der zweite primäre Antikörper1gefärbt wird. Das Abisolieren von Antikörpern, das dem Streifen und der Reprobe eines westlichen Fleckenblattes ähnelt, entfernt den zuvor gebeizten Antikörperkomplex, ohne die Ablagerung nachweisbarer Reportermoleküle wie 3,3′-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)2 und die fluoreszierende Tyramidabscheidung3zu entfernen. Mit dieser Methode können Reportermoleküle in verschiedenen Farben ein Multiplex-Ergebnis auf derselben Folie anzeigen. Die Multiplexfärbung ist auch durch die vollständige Entfernung der zuvor abgelagerten Antikörperschichten und die Ausrichtung nachträglich aufgenommener Bilder von anderen Antikörpernerreichbar 4,5. Diese Methoden liefern alle zuverlässige Ergebnisse, obwohl jede Methode ihre Grenzen hat und entweder komplizierte Verfahren oder ein spezielles Bildgebungssystem erfordert.
Das vorliegende Protokoll zeigt die Anwendung einer Antikörper-Stripping-Methode unter Verwendung allgemein verfügbarer Puffer. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten mit zwei nicht beschrifteten primär antikörpern den gleichen Wirtsarten durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multiplex-Immunostaining ist nützlich, um die zelluläre Kolokalisierung von zwei oder mehr Antigenen zu untersuchen. Diese weit verbreitete Technik liefert überzeugende Kolokalisierungsergebnisse, wenn primäre Antikörper mit verschiedenen Reportern konjugiert werden (direkte Färbung). Jedoch, direkte Färbung bietet in der Regel schwächere Signale im Vergleich zu indirekten Färbung, die konjugierte sekundäre Antikörper beinhaltet, um die primären Antikörper zu erkennen. Bei der indirekten Färbung beruht ein …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von NIH R00 HD032636 unterstützt.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
Referencias
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
