폴리전해질 복합 미셀의 조립 및 특성화
Summary
당사는 폴리전해질 복합 미셀, 폴리전해질 및 친수성 전하 충전되지 않은 블록 공중합체에 의해 형성된 코어 쉘 나노입자를 설계, 조립 및 특성화하기 위한 프로토콜 및 대표 데이터를 제공합니다.
Abstract
다연화 질화 복합 미셀 (PCMs), 수성 용액에서 충전 된 폴리머의 자체 조립에 의해 형성 된 코어 쉘 나노 입자는 다연화 물질 상호 작용의 물리학을 탐구하기위한 강력한 플랫폼을 제공하고 또한 유망한 솔루션을 제공합니다. 생체 내에서 치료 올리고뉴클레오티드를 전달하는 시급한 문제. PCM에 대한 예측 구조-특성 관계를 개발하는 것은 나노 입자 자체 조립 중에 강력한 운동 트랩이 존재하기 때문에 부분적으로 어렵다는 것이 입증되었습니다. 이 문서에서는 PCM 시공을 위한 폴리머 선택 기준에 대해 설명하고 반복 가능한 저다분산성 나노입자의 조립을 가능하게 하는 염조를 기반으로 하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 빛 산란, 작은 각도 X 선 산란 및 전자 현미경 검사법을 사용하여 PCM 특성화에 대해 설명합니다.
Introduction
반대로 충전 된 폴리 전해질이 수성 용액에 혼합되면, 그들의 카운터션의 방출로 인한 엔트로피 이득은 용액을 중합체가 풍부한 응축상으로 분해하고 중합체 고갈 된상층1,2,3,4,5,폴리 전해질 복합화로 알려진 현상을 일으킨다. 중성 친수성 블록이 폴리전해질 중 하나 또는 둘 다에 공액화되는 경우, 나노스케일 상 분리가 대신 발생한다(도1A). 생성된 자체 조립 된 코어 쉘 나노 입자는 다양하게 시스템의 모든 구성 요소가 친수성6,7임에도불구하고, 계면 활성제 미셀화에 비유하여 폴리 전해질 복합 미셀 (PCM), 폴리이온 복합 미셀, 블록 이오노머 복합체 또는 응축코어 미셀로 지칭된다. 단백질 및 핵산과 같은 친수성 분자를 캡슐화하는 PCM의 능력뿐만 아니라 블록 공중합체 담체 아키텍처에 의해 제공되는 광범위한 튜닝성은 생체 내 치료분자를생체 내에서 전달하기위한 매력적인 후보를 만든다8,9,10, 11,12, 13.
세포 표적에 치료 핵산을 전달하는 것은 특히 중요한 도전이며, PCM은 몇 가지 이점을 제공합니다. 치료핵산(유전DNA, mRNA 및 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드)은 인간의 건강을 개선하기 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있지만, 그 잠재력을 실현하기 위해서는 수많은 생물학적 및 물리적 장벽을 극복해야 한다14,15,16. 베어 핵산은 혈청과 세포 뉴클레아제에 의해 분해되고, 순환에서 빠르게 제거되며, 강한 음전하가 도움없이 세포막을 관통하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 장벽을 극복하기위한 현재의 접근법은 소수성 상호 작용을 통해 조립 된 다양한 지질 나노 입자로의 뉴클레아제 및 / 또는 캡슐화로의 손상을 방지하기 위해 비용이 많이 드는 화학 적 변형을 포함15,17,18. 이러한 방법은 국소 주사 및 간 표적화에 효과가 입증되었지만, 전신 사용은 독성, 면역원성 및 제한된 생체 분포16의상당한 한계를 제시한다. 대조적으로, PCM은 핵산의 음전하를 사용하여 위상 분리 코어 내에서 응축하는 반면, 중성 코로나는 타게팅 또는 내재화를 향상시키기 위해 리간드를 통합하는 플랫폼뿐만 아니라 분해에 대한 고정 장벽을 제공합니다11,19. 생체 외 및 동물 연구에 따르면 PCM은 다양한 핵산 페이로드20,21,22,23,24를효과적으로 전달할 수 있지만 구성 폴리머의 특성에서 크기, 모양 및 안정성과 같은 PCM 특성을 예측하는 능력의 약점은 더 넓은 채택을 방해했습니다.
우리 그룹 및 현장에서 다른 사람들에 의한 최근 연구는 구조-성질을 개발함으로써 이 문제를 해결하기 시작했으며, 경우에 따라 핵산 및 다양한 양이온 중성 중합체7,25,26,27로형성된 PCM에 대한 구조-특성-기능 관계를 개발하고 있다. 이러한 연구에서 나온 두 가지 일관된 주제는 PCM 어셈블리를 위한 잘 제어되고 반복 가능한 프로토콜을 개발하는 것의 중요성과 결과 나노 입자를 특성화하기 위해 여러 기술을 사용하는 이점입니다. 폴리전해질, 특히 핵산과 같은 전하 밀도가 높은 사람들은 서로 매우 강하게 상호 작용하며, 혼합 시 쉽게 문제가 되는 것처럼 보이며, PCM 제제는 절차의 작은 변화에 매우 민감하며 배치마다 높은 다분산성과 불쌍한 반복성을 표시합니다. PCM은 또한 구성 요소의 원자 수준 구성에 따라 다양한 모양과 크기를 채택하는 것으로 나타났으며, 특히 동적 광 산란(DLS)과 같은 일부 일반적인 기술은 해석을 위해 입자 모양에 대한 가정이 필요하기 때문에 개별 특성화 기술로 이러한 다양성을 캡처하는 것은 매우 어렵습니다.
이 기사에서는 올리고뉴클레오티드 및 양이온 중성 디블록 공중합체에 중점을 둔 PCM의 재료 설계 및 선택에 대해 논의합니다. 그런 다음 PCM 조립 중에 운동 트래핑을 피하기 위해 느린 투석을 위해 높은 염 농도를 사용하는 소금 어닐링 프로토콜을 설명합니다. 폴리전해질은 정전기 적 매력이 스크리처되는 높은 염분 조건에서 혼합된 다음 염 농도가 서서히 낮아져 폴리전해질이 가장 정력적으로 유리한 구성에 정착할 수 있도록 하며, 이는 열 어닐링의 느린 냉각 과정과 유사합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 올리고 뉴클레오티드 PCM7,26에대한 매우 낮은 다분산성과 높은 반복성을 달성 할 수 있습니다. 마지막으로, 외부 형태에서 내부 구조에 이르기까지 매우 광범위한 길이 척도에서 DLS, 다각형 광 산란(MALS), 소형 각도 X선 산란(SAXS), 투과 전자 현미경(TEM)에 이르기까지 4가지 개별 측정 기술을 사용하여 PCM을 특성화하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 이 프로토콜이 더 많은 연구자들이 이 흥미로운 나노입자의 기능을 효과적으로 탐구할 수 있기를 바랍니다.
폴리머 선택 및 준비
PCM 특성은 구성 폴리머의 물리적 및 화학적 특성에 의해 크게 영향을 받아 폴리머 선택을 설계 공정에서 중요한 단계로 만듭니다. 핵산 PCMs를 위한 가장 잘 특징지어진 블록 공중합체는 폴리(lysine)-폴리(ethylene glycol)(pLys-PEG)와 같은 선형 디블록이지만, PCM은 폴리전해질과 다양한 친수성 중화기 사이에서 형성될 수 있으며, 이는 높은 처리량 방식으로 생성될 수 있다28. 충전된 그룹의 선택은미셀(26)의이온 페어링 및 형상의 안정성에 강하게 영향을 미치며, PCM 크기는 충전된 블록5,7,26(도 26)의길이에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 따라서 원하는 애플리케이션의 요구 사항에 맞게 PCM 특성을 조정할 수 있도록 한다. 선형 디블록의 경우, 충전된 블록에 최소 10개의 충전이 있어야 하며 원하는 pH에서 강하게 충전되어야 합니다. 더 오래 충전된 블록은 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 가진 PCM 형성을 촉진할 수 있고, 이는 더 짧은블록(21)과함께 복잡하기 어렵다. 우리는 성공적으로 200까지 블록 길이와 PCM 형성을 관찰하고, 문헌은 더 긴 중합체를 기술합니다. 더 많은 유연성은 중립 블록(24)의선택에서 사용할 수 있지만, 경험은 매우 짧은 중립 블록이 나노 입자 형성보다는 응집으로 이어질 것으로 나타났습니다, 충전 된 블록 길이에 따라 최소 중립 길이가 증가한다는 것을. plys-PEG의 경우 최소 3,000~5,000의 PEG MW가 ~50 이하의 plys 길이에 필요하며, 충전된 블록이 더 증가함에 따라 더 긴 길이가 필요합니다. 중립 블록 길이가 증가하면 중성 중합체의 입체 밀집성 군집으로 인해 PCM 크기, 특히 쉘 두께가 증가합니다.
이 원고는 동질성 고순도 pLys-PEG 및 알려진 수량의 올리고뉴클레오티드에서 PCM을 준비하기위한 프로토콜을 제공하지만 다른 시스템에도 쉽게 적응할 수 있어야합니다. 우리는 폴리 아르 기닌과 폴리 글루타믹 산을 포함한 여러 충전 된 폴리 펩티드뿐만 아니라 폴리 아크릴 산 및 폴리 (비닐 벤질 트리메틸 라모늄)와 같은 여러 합성 폴리 전해질로 성공적으로 테스트했습니다. 우리는 또한 다전기 분해 전하의 stoichiometric 비율로 PCM을 준비하는 것을 기술합니다, 그러나 이것은 쉽게 수정됩니다. 우리는 또한 자연적으로 완전히 충전되지 않은 폴리머를 수용 충전 농도 단위 (c.c.)에서 작동하는 것이 가장 쉬운 찾을 수 있습니다. 중합체 중 어느 하나도 잘 특성화되지 않은 경우, 폴리머 길이/질량을 정확하게 결정하고 투석에 의한 전하 중화에 필요한 것 이상으로 과도한 염분이 존재하지 않도록 주의해야 합니다. 농도가 계산될 때 보유수의 존재도 고려해야 합니다. 핵산 농도는 260 nm에서의 흡광도에 의해 편리하게 정량화될 수 있으며, c.c를 계산할 때 말단 인산염의 유무를 고려해야 한다.
올리고뉴클레오티드를 폴리아나온으로 사용하는 경우, 혼성화 상태 및 화학적 구조는 자가 조립에 대한 성향 및 생성된 PCM5,7,26의특성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이들을 최적화하면 PCM을 사용하여 전달을 위해 사용하는 경우 생물학적 효능에 대한 요구 사항 내에서 원하는 구조를 형성할 가능성이 높아집니다. 혼성화를 분석하기 위한 유용한 도구로는 핵산용 MATLAB 기능, NUPACK29및 IDT 올리고분석기 등이 있습니다. 후보 서열을 분석하여 1) 헤어핀 형성에 대한 결합 강도를 이해하는 것이 좋습니다. 2) 동일한 시퀀스의 또 다른 사본(자가 이광); 및 3) 시스템에 존재하는 다른 올리고뉴클레오티드에. 특정 서열에 대한 DNA 및 RNA 용융 온도는 또한 가장 가까운 이웃 방법30,31을사용하여 계산될 수 있다. 핵산의 열 어닐링 (단계 2.3)은 개별 뉴클레오티드에서 임의의 잔류 이차 구조를 변성시키고 평형 폴딩을 촉진합니다.
PCM 특성화 및 분석
정적 및 동적 광 산란, 전자 또는 중성자의 작은 각도 산란 및 전자 현미경을 포함한 나노 입자를 특성화하는 데 다양한 기술이 제공됩니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 광 산란 기술, 작은 각 엑스레이 산란 및 2개의 전자 현미경 기술에 대한 프로토콜을 제공합니다.
DLS는 샘플의 브라운 모션에서 한 각도로 산란 강도의 시간 적 변동의 자기 상관을 측정합니다. 이 데이터를 피팅하면 구형 미셀에 대한 유체역학적 반지름 및 다분산성을 제공할 수있습니다(그림 3). 다중 각도 라이트 산란(MALS)은 여러 각도에서 정적 산란 강도를 측정합니다. 이 각도 의존성은 나노 입자의 모양을 설명하지만 가시 광선의 경우 ~ 50 nm보다 긴 길이 스케일로 제한되어 더 작은 나노 입자에 대한 효과를 제한합니다. 두 기술은 굴절률 불일치를 기반으로 하며 주로 나노입자의 외부 치수를 설명합니다.
작은 각도 X선 산란(SAXS)은 X선을 산란 프로브로 사용하며 파장이 짧을수록 ~0.1-100nm 범위에서 측정할 수 있습니다. 관찰된 산란 강도 대 각도(통상적으로 운동량 전달 q로표현)를 피팅하면 PCM 형태(즉, 크기 및 모양)와 내부 구조에 대한 정보를 제공합니다. 절대 강도 교정을 사용할 수 있고 산란 강도를 0 각도로 추정할 수 있는 경우 PCM 질량 및 집계 번호도32로추정할 수 있으므로 SAXS는 매우 다양하고 가치 있는 방법입니다. 작은 각도 중성자 산란 (SANS)은 길이 스케일의 유사한 범위에 민감하지만 전문 시설에서만 사용할 수 있으며 이조33,34,35에서명시적으로 논의되지 않습니다.
최근 몇 년 동안 벤치 탑 SAXS 계측기의 출현을 보았지만, 싱크로트론 소스가 PCM 특성화에 더 적합하다는 것을 알게되었습니다. 고급 광자 소스(아르곤 국립 연구소, 미국)의 Beamline 12-ID-B에서 PCM SAXS 데이터를 사용자 관점에서 수집하기 위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 대부분의 싱크로트론 소스에 적용되어야 하지만 실험을 제안하기 전에 현지 직원과 상의하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 Irena36,Igor Pro를 위해 작성된 매크로의 무료 세트를 사용하여 데이터 감소 및 분석 프로토콜을 제공합니다. Irena는 SAXS 데이터를 모델링하기 위한 다양한 폼 팩터 세트를 포함하고 있으며 PCM의 복잡한 산란 프로파일을 설명할 수 있는 다성분 모델을 구성할 수 있습니다(대표 결과, 그림 4참조). Irena는 또한 포괄적인 문서와 자습서를 온라인으로 사용할 수 있습니다. 아래 절차를 시도 하기 전에 이러한, 특히 자습서 “두 개의 주요 분산 모집단SS 데이터 모델링”에 익숙해 하는 것이 좋습니다.
방사선 손상은 X선 산란의 문제이지만 이를 최소화하기 위해 여러 가지 조치를 취할 수 있습니다. 특히, 밀폐된 모세관이 아닌 데이터 수집 중에 흐르는 주사기 펌프 및 PCM 샘플이 있는 유량 셀 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 또한 크게 배경 뺄셈을 단순화. 우리는 또한 샘플의 단일 볼륨이 보는 플럭스를 제한하고 노출 데이터를 비교하여 손상을 식별 할 수 있도록하기 위해 흐르는 샘플의 여러 노출을 하나이상 복용하는 것이 좋습니다.
일반적으로 해석하기 위해 피팅을 필요로 하는 산란 기술과는 달리, 투과 전자 현미경(TEM)은 샘플을 통해 전자 빔을 통과하고 침전 스크린상에 이미지를 투사함으로써 나노입자의 실제 공간 시각적 이미지를제공한다(도 5). 이 문서에서는 두 가지 TEM 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다. Cryo TEM은 미셀 샘플을 유리체 얼음의 얇은 층으로 동결시켜 최소한의 이물질로 구조적 변형을 보존하여 반경 미셀 ≤~10-100 nm에 최적입니다. 네거티브 스테인 TEM은 중금속 염(예: 우라늄)을 사용하여 그리드 표면에서 건조된 후 시료를 둘러싸습니다. 조밀 한 얼룩은 대비를 추가하고 샘플의 부정적인 이미지를 생성, 샘플보다 더 많은 전자를 산란합니다. 고품질 이미지에는 Cryo TEM이 권장됩니다. 그러나 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며 대비가 충분하지 않을 수 있습니다. 이것이 우려되는 경우, 부정적인 염색 샘플을 사용해야합니다. 각각의 예는 그림 5에도시되어 있습니다.
이러한 각 기술은 서로 다른 강점과 한계를 가진 나노 입자의 약간 다른 양상에 보고합니다. 광 산란은 쉽게 사용할 수 있으며 종종 가장 빠른 접근 방식이지만 크기와 형상 해상도에는 상당한 제한이 있습니다. SAXS는 합리적으로 높은 처리량으로 광범위한 길이 스케일에 대한 정보를 제공할 수 있지만 데이터를 수집하기 위한 특수 장비와 이를 해석하기 위한 모델링이 필요합니다. TEM 이미지는 해석하기 쉽지만 대조적으로 제한될 수 있으며 본질적으로 처리량이 낮습니다. 우리의 경험은 특성화를 위해 여러 기술을 사용하면 PCM 속성에 대해 얻을 수있는 정보가 크게 증가하고 각 기술에서 얻은 데이터 세트의 해석을 단순화하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어 SAXS와 TEM은 주로 PCM의 조밀한 코어를 검사하는 반면, 광 산란은 나노 입자의 전체 치수에 대한 보고서를 작성합니다. 따라서 이를 결합하면 코어와 코로나 크기를 모두 측정할 수 있습니다. 실제 공간 이미지를 획득하는 TEM의 기능은 근거 자료 데이터를 제공하여 모호할 수 있는 SAXS 데이터를 모델링하는 데 적합한 폼 팩터를 선택할 수 있도록 합니다. 이 문서에서는 네 가지 기술에 대한 프로토콜에 대해 설명하고 이를 사용하여 알 수 없는 샘플을 특성화하는 예제 프로세스가 토론 섹션에 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 언급 한 바와 같이, 여기에 제시 된 프로토콜은 양온 중성 블록 공중합체로 폴리안 이온 성분 및 pLys-PEG로 올리고 뉴클레오티드에 초점을 맞추고 작성하지만, 우리는 폴리 (아크릴 산), 폴리 글루타메이트 및 PEG 폴리 (비닐 벤질 트리메틸 라몬)와 같은 다양한 폴리머로 테스트했으며, 일반적으로 폴리에 적용 될 것이라고 믿습니다. 최적화해야 할 한 가지 매개 변수는 어닐링에 사용되는 염 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시카고 대학에서 소프트 물질 특성화 시설과 고급 전자 현미경 검사 시설의 필 그리핀과 테라 라부아에게 각각 감사드립니다. 또한 아르곤 국립 연구소와 NIST 계층 재료 설계 센터(CHiMaD)의 고급 광자 소스의 샤오빙 주오와 소엔케 세이퍼트에게 감사를 표합니다. 이 작품에 기여한 제프 팅과 마이클 루에하이드에게 감사드립니다.
Materials
| 70 mm circle filter paper | Whatman | 1001-070 | Filter paper for wicking during grid prep |
| Carbon Film TEM grid | Electron Microscopy Sciences | CF200-Cu | TEM grid |
| DAWN | Wyatt Technology | DAWN | MALS instrument |
| DNA oligonucleotide | Integrated DNA Nanotechnologies Inc | Custom oligonucleotide | |
| Lacey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | LC200-Cu | TEM grid |
| Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 | Alamanda Polymers Inc | mPEG5K-b-PLKC50 | Example block copolymer |
| Milli-Q | Millipore Sigma | Ultrapure water | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | For measuring nucleic acid concentration | |
| negative-action tweezers | Dumont | N7 | Tweezers for grid preparation |
| Parafilm "M" | Bemis Company Inc | PM996 | Laboratory film |
| Quantifoil Holey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | Q210CR1.3 | TEM grid |
| Research Goniometer and Laser Light Scattering System | Brookhaven Instruments | BI-200SM | DLS/MALS instrument |
| Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL | Thermo Scientific Pierce Protein Biology | 87723 | Dialysis cartridge |
| small volume cuvette | Brookhaven Instruments | BI-SVC | Cuvette for DLS/MALS |
| Solarus 950 Advanced Plasma System | Gatan | Solarus 950 | Plasma system for TEM grids |
| Talos TEM | FEI | Talos | TEM used for cryo samples |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | Spirit | TEM used for dry samples |
| Uranyl Formate | SPI-Chem | 16984-59-1 | For negative staining samples for TEM |
| Vitrobot | FEI | Vitrobot | Vitrification robot for cryo grid preparation |
Referencias
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