Büyük pelvik gangliyonlar pelvik organları innerve parasempatik ve sempatik nöronlar içerir. Burada bir diseksiyon yöntemi tanımlamak ve bu gangliyonlar ve ilişkili sinirlerin belirlenmesi için şemalar sağlar. Bu yöntemler daha fazla çalışma için in vivo veya removal post-mortem bu ganglia deneysel manipülasyon uygulanabilir.
Bilateral majör pelvik gangliyonu (MPG; eşanlamlı, pelvik ganglia) postganglionik sempatik ve parasempatik nöronların kemirgenlerin pelvik organlarını innerve eden birincil kaynağıdır; insanlarda fonksiyonel olarak eşdeğer yapı inferior hipogastrik pleksus. Büyük pelvik gangliyonlar da hangi lomber ve sakral duyusal aksonlar pelvik organlara ulaşmak hangi rota sağlar. Bu karmaşık, karışık gangliyonlar tanımlamak ve normal otonom mekanizmaların daha deneysel çalışma için diseksiyon veya hastalık preklinik modelleri kurmak için zor kanıtlayabilirim, yaralanma veya visseral ağrı. Burada bu gangliyonlara ve bunlara bağlı sinir yollarına erişmek ve görselleştirmek için bir protokol uyguluyoruz. Bu protokolü hem erkek hem de dişi sıçanlar için şemalar sağlıyoruz, çünkü kimlik tespiti için ganglion boyutu ve işaretleri cinsiyetler arasında farklılık göstermektedir. Protokol, in vitro çalışmalar için ganglion’un çıkarılmasını açıklar, ancak bu yöntem deneysel müdahaleler (örn. sinir ezilmesi, sinir rezeksiyonu) veya nöronal devrelerin haritalanması (örn. mikroenjeksiyon ile) için cerrahi bir kurtarma protokolüne entegre edilebilir. nöral izleyiciler). Ayrıca diseksiyonun hemen ardından ve immünohistokimyasal boyamasonrasında ganglion ve ilişkili sinirlerin birincil yapılarını gösteririz.
Sıçan pelvik organ fizyolojisi ve anatomi çalışmalarında kullanılan en iyi karakterize türlerden biridir. Mükemmel kaynaklar bu organların açıklamaları için var iken1,2, genellikle ilgili nöral yapılar hakkında bilgi vermez ya da deneysel bir çalışma rehberlik etmek için yetersiz çözünürlükte bunu. Aşağıda ayrıntılı olarak, pelvik organ fonksiyonunu düzenleyen otonom ganglia organizasyonu otonom sinir sisteminin geri kalanından oldukça farklıdır, diğer otonom ganglia için mevcut nöroanatomik bilgilerden pelvik innervasyon özelliklerini doğru bir şekilde çıkarmanın zor olduğunu. Bu alana giren araştırmacılara rehberlik etmek için kaynaklardaki bu eksiklik pelvik organların nöral düzenlenmesi üzerine yapılan araştırmaları yavaşlatmış olabilir. Burada daha fazla in vitro çalışmalar veya deneysel müdahale için sinir sisteminin bu bölgeye erişim için protokoller açıklar.
Bilateral majör pelvik gangliyonlar (MPG; eş anlamlı: pelvik ganglia; paraservikal ganglia [kadın]; Frankenhäuser ganglion [kadın]) postganglionik sempatik ve parasempatik nöronlar kemirgenlerin pelvik organları innerve birincil kaynağıdır; inferior hipogastrik pleksus insanlarda eşdeğer nöronal yapı oluşur3,4,5,6. Lomber ve sakral dorsal kök gangliyonundan duyusal projeksiyonlar da pelvik organlara ulaşmak için MPG ile seyahat. Bu nedenle, MPG’nin nöral devresi ve biyolojisinin anlaşılması pelvik organların gelişimi ve erişkin işlevi ile ilgili sayısız klinik durum üzerinde yapılan klinik öncesi çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Kemirgen MPG birkaç mükemmel açıklamalar yayınlanmıştır7,8, ama bizim deneyim genel olarak bu açıklamalar her zaman pratik bir deneysel diseksiyon veya hayvan kurtarma gerektiğinde bu yapıların manipülasyon bilgilendirmek için yeterli rehberlik sağlamaz olmasıdır. Ayrıca, MPG çalışmalarının çoğunluğu erkek sıçanlar üzerinde duruluyor. Kadın sıçanlarda, MPG daha küçük9 ve farklı anatomik yerler var, ve bu nedenle görselleştirme ve diseksiyon için belirgin bir özel kılavuz gerektirir.
Sempatik ve parasempatik yollar anatomi ile ayırt edilir, özellikle preganglionik nöronların yeri, torako-lomber omurilik ve parasempatik preganglionic nöronlar beyin sapı bulunan preganglionik nöronlar olan sempatik yollar ile (kranial sinir projeksiyonları) ve sakral omurilik. Otonom sistemin diğer birçok bölgesinde, hedef ganglion nöronlar farklı sempatik veya parasempatik gangglia bulunmaktadır. Ancak, MPG karışık sempatik-parasempatik gangliyon olması alışılmadık, ve bu nedenle makroskopik ölçekte hem torako-lomber ve sakral spinal bölgelerin preganglionic aksonlar yakınsama siteleri vardır. Bu nedenle protokollerimize her bir spinal bölgeyi MPG’ye bağlayan ve deneysel analizi kolaylaştıran veya bu sinir bileşenlerinin ayrı manipülasyonu yapan bu primer sinir yollarının yerini ve tanımını ekledik. Biz de özellikle türler arasında bu gangliyonları karşılaştıran okuyucular için not, kemirgenler ‘fonksiyonel sakral’, örneğin, aktif ve micturition sırasında gerekli olan spinal preganglionic nöronlar, dışkılama ve penil ereksiyon sırasında gerekli, spinal düzeylerde bulunan L6-S1 yerine sadece sakral segmentleri10; aynı şekilde L6 ve S1 dorsal kök gangliyonu pelvik organlara büyük ‘sakral’ duyusal giriş sağlar. Kemirgenlerde, daha rostral nöral devrelerden duyusal ve preganglionik giriş spinal düzeylerde L1 ve L210yoğunlaşmıştır.
Burada erkek ve dişi sıçanlarda MPG ve ilişkili sinir yolları erişmek için bir protokol açıklar ve belirli işaretleri göstermek için şemalar ile bu destek. Bu protokol, bu yapılara, örneğin moleküler karakterizasyon veya birincil kültür için MPG nöronlarının izole edilebilmektedir. Ayrıca fiksatif ile intrakardiyak perfüzyon sonrası MPG çıkarılması için adapte edilebilir, nöral doku komşu dokular kan yoksun olduğunda görselleştirmek için daha zor hale gelir, çünkü bu daha zor bir diseksiyon olmasına rağmen. Bu protokol aynı zamanda bu sinir yollarının deneysel müdahalesi için cerrahi bir ortama entegre edilebilir (örn. sinir rezeksiyonu, sinir selizatlarının mikroenjeksiyonu). Bu tip diseksiyonlar, pelvik visseranın klinik koşullarını tedavi etmek için nöromodülasyon için yeni hedeflerin ve yaklaşımların geliştirildiği biyoelektronik tıbbın büyüyen alanı için giderek daha önemlidir11. Önce erkek sıçanlar için protokolün tamamını sıyoruz, sonra da dişi sıçanlar için özel olarak hazırlanmış protokolün bir kopyasını.
Pelvik organların nöral kontrolü somatik, parasempatik, sempatik ve visseral duyusal bileşenler14,15,16,17dahil olmak üzere karmaşık yollar aracılık edilir. Bu yolların çoğu kökenli veya MPG geçer. Burada özetlenen diseksiyon protokolleri MPG anatomisine, ilgili sinirlere ve yakındaki makroskopik anatomik yapılara giriş sağlar; ikincisi anatomik şemalar ile gösterilmiştir. MPG diseksiyonu için diğer yaklaşımlar da başarılı olabilir, ama biz burada açıklanan bir sağlam ve sinir sisteminin bu alanda yeni bir araştırmacı için uygun olarak bulabilirsiniz.
Protokolün en kritik yönleri her büyük sinirin doğru tanımlanması ve MPG dokusunun tamamen çıkarılmasıdır. Dokuların dikkatli bir şekilde izlenmesi ve işlenmesi ile MPG dokuları anatomik, moleküler ve elektrofizyolojik in vitro çalışmalar için çıkarılabilir18,19,20,21,22. Protokol aynı zamanda in vivo deneysel manipülasyon için adapte edilebilir23,24,25, Bu durumda, ganglion ile ilişkili birincil sinirler ile teması en aza indirmek için büyük dikkat alınması gerektiğini belirterek veya yakındaki vaskülatür zarar. Deney bir veya daha fazla sinirin kesilmesi yle seçici denervasyon gerektiriyorsa, reinnervasyonu ve analizlerin kafa karıştırıcıolmasını önlemek için kopmuş sinirin infilak etmesi önerilir. Bu diseksiyon protokolü de fare için kullanılabilir, karşılaştırılabilir fonksiyonu ile bir MPG de var26,27,28.
Nöroanatomik çalışmalar için, antijenlerin ve doku yapısının en iyi korunması, mpg’nin deneye uygun histolojik fiksatif ile transkarjik olarak perfore edilmiş anestezili bir hayvandan kesilmesiyle elde edilir29; ancak bu süreçten sonra doku renklenmesi kaybolduğundan ganglion ve sinir yapılarının belirlenmesi daha zordur. Perfüzyon sonrası bu diseksiyonu denemeden önce ganglionun perfüzyonsuz hayvanlardan tanımlanması ve kesilmesinde usta lık olması önerilir. Aynı şekilde, eşdeğer yaş ve vücut boyutu hayvanlar için, MPG ve ilişkili sinirler kadınlarda çok daha küçük olduğu için ilk erkeklerde diseksiyon yeterli olmak için tavsiye edilir.
Çıkarılan doku gerçekten MPG olduğunu doğrulamak için, araştırmacı ilk her birincil sinir in yerini ve özelliklerini kontrol etmek için tavsiye edilir. Birçok dissectors pelvik sinir ve kavernöz sinir yerinde tanımlamak için en kolay bulabilirsiniz; hipogastrik ve aksesuar sinirler daha hassas ve daha çevre doku ayırt etmek zordur. Eğer bu sinirler diseksiyon sırasındaki sorunlar nedeniyle artık mevcut değilse veya yapıları ile ilgili belirsizlik varsa, ilk MPG diseksiyonları konvansiyonel histoloji ile karakterize dir (nöronal hücre organlarının varlığını doğrulamak için8) ve ikinci olarak immünhistokimya (hem kolinerjik hem de noradrenerjik nöronların mevcut olduğunu belirlemek için30,31) (Şekil 3). Majör sinirlerin doğru belirlenmesini doğrulamak için, kavernöz sinirler kolayca MPG yakın ilk bölümünde nöronal hücre organlarının yüksek yoğunluklu tarafından tanımlanır; bu nöronların çoğu kolinerjik belirteçleri ifade, nitrergic nöronlar32,33. Pelvik, hipogastrik ve aksesuar sinirler çok az nöronal hücre organları var34.
Bu diseksiyon gerçekleştirirken çeşitli ortak tuzaklar vardır. Acemi dissectors herhangi bir büyük sinirler veya MPG bulma sorunları varsa, onlar önemli işaretleri açıklayan adımlara dönmek için teşvik edilir. Makroskopik bağlamın izini kaybedilebilen mikroyapıları bulmaya bu kadar odaklanmak çok yaygındır. En yaygın olarak, acemi dissectors ya kendi diseksiyon yerinde çok ileri rostral hareket ya da çok ‘yüzeysel’-i.e., çok yakın karın ventral açılış, yerine derin inceleyerek kalır (yani, daha fazla dorsal) yapıları. Diseksiyon sırasında sık karşılaşılan bir sorun, diseksiyon sırasında vaskülatürhasarıdır. Kanama başlarsa, kanama durana kadar yavaşça kaynağın üzerinde pamuk uçlu bir aplikatör tutun, sonra diseksiyonu yeniden başlatmadan önce bölgeyi tuzlu suyla temize çıkar. Çok fazla kanla kirlenmişse veya kanamanın durmasını beklerken diseksiyon çok uzun süre gecikirse MPG deneyler için kullanılabilir olmayacaktır. Başka bir yaygın diseksiyon hatası önemli ölçüde MPG görme ve kaldırma bozar prostat bezinin kapsül hasardır. Bu kapsül kolayca prostatlateral duvardan yağ kaldırırken delinmiş çok hassas bir yapıdır, sadece bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak bile. Son olarak, MPG ile ilişkili ana sinirler kolayca her biri belirleme işlemi sırasında ve daha sonra MPG kaldırılması sırasında zarar görür. Dissectors her sinir sırayla izole bir rutin geliştirmek için teşvik edilir, belirli bir sırada, böylece ganglion kaldırma son adımları sırasında karışıklık için daha az fırsat var.
Bu diseksiyon belirli organlara aksesuar sinirlerin bileşenlerinin her izlemek için, ya da pelvik ganglia ve pelvik organlar arasında çeşitli noktalarda yalan birçok mikroganglia her tanımlamak için aramadı8. Bu belirli lekeler kullanmadan in vivo görselleştirmek için oldukça zordur; ancak, organlara doğru sinir yollarının her birini izleyerek kaldırılabilir, ve ganglion yerini belirlemek için belirli nöral lekeler sonrası hoc kullanarak. Bu mikroganglia, MPG ile karşılaştırıldığında nöronal popülasyonun sadece küçük bir kısmını meydana germe rağmen, onlar en yakın bulunan organlara giriş belirli türleri sağlayabilir. Burada ne bu mikroganglia ne de pelvik organlara seyahat etmek için MPG çıkan küçük sinir yollarının çok henüz geniş adlarını kabul sahip alanında bir sınırlama dikkat edin. Ayrıca, mikroganglia benzer ayrıntılı bir çalışma henüz kadın sıçanlarda yapılmıştır olmamıştır.
Özetle, burada sağlanan protokol ve şemalar, araştırmacılara pelvik organlara otonom sinir kaynağı sağlayan birincil yapıları ve lumboakral dorsal kökten duyusal sinirlerin başlıca periferik kanallarını incelemek için araçlar sağlar. leğen organlarına MPG ile seyahat ganglia.
The authors have nothing to disclose.
Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Koşulları Rahatlatmak için Çevresel Aktiviteyi Teşvik Eden (SPARC) Programı, Ot2OD023872 Ödül Numarası Direktörü Ofisi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Dr. Bertrand’ın Dr. Keast’in laboratuvarındaki bursu: Nîmes Üniversitesi Hastanesi, Montpellier-Nîmes Tıp Fakültesi, Derneği Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinaire Francophone d’Uro Avrupa Birliği’nin Yedinci Çerçeve Programı’nın (FP7/2007-2013) Dynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) ve Rea hibe anlaşması no PCOFUND-GA-2013-609102 uyarınca, Kampüs tarafından koordine edilen PRESTIJ programı ile İnsan Programı (Marie Curie Eylemleri) Fransa.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |