Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.
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Artículo de método
Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis
En este artículo
Resumen
Resumen
La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas más frecuentes, que afecta a los pacientes que sufren de dolor y limitaciones físicas. La evidencia reciente indica un componente inflamatorio potencial de la enfermedad, con células T y monocitos/macrófagos potencialmente asociados con la patogénesis de OA. Otros estudios postularon un papel importante para subconjuntos de linajes celulares inflamatorios, como Th1, Th2, Th17 y linfocitos reguladores de T, y M1, M2 y macrófagos residentes en tejidos sinovium. Sin embargo, se desconoce la interacción entre la respuesta celular inflamatoria sinovial y sistémica local y los cambios estructurales en la articulación. Para entender completamente cómo las células T y los monocitos/macrofagos contribuyen hacia el OA, es importante ser capaz de identificar cuantitativamente estas células y sus subconjuntos simultáneamente en el tejido sinovial, los órganos linfáticos secundarios y sistémicamente (el bazo y la médula ósea). Hoy en día, los diferentes subconjuntos de células inflamatorias se pueden identificar mediante una combinación de marcadores de superficie celular haciendo de la citometría de flujo multicolor una técnica poderosa en la investigación de estos procesos celulares. En este protocolo, describimos pasos detallados con respecto a la cosecha de tejido sinovial y órganos linfáticos secundarios, así como la generación de suspensiones de una sola célula. Además, presentamos tanto un ensayo de tinción extracelular para identificar monocitos/macrofagos y sus subconjuntos, así como un ensayo de tinción extra e intracelular para identificar las células T y sus subconjuntos dentro del bazo murino, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el tejido sinovial. Cada paso de este protocolo fue optimizado y probado, resultando en un ensayo altamente reproducible que se puede utilizar para otros modelos de ratón OA quirúrgicos y no quirúrgicos.
Introducción
La osteoartritis (OA) es una enfermedad debilitante y dolorosa que involucra diversas patologías de todos los tejidos asociados con la articulación1. Afectando aproximadamente al 3,8% de la población mundial2,OA es una de las enfermedades musculoesqueléticas más prevalentes y se convertirá en la4a causa de discapacidad líder en todo el mundo para 20203. La OA postraumática ocurre después de una lesión articular y representa al menos el 12% de toda la OA y hasta el 25% de la OA en articulaciones susceptibles como la rodilla4,,5. ....
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Protocolo
El Comité de ética animal del Distrito De Salud Local del Norte de Sídney ha aprobado todos los procedimientos mencionados en este protocolo. Los ratones son alojados y cuidados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia Revisado 2010). Para todos los experimentos se utilizaron ratones macho C57BL/6 de 10-12 semanas de edad.
NOTA: Para inducir la OA postraumática, se realizó la desestabilización quirúrgica del menisco medial (DMM) en la articulación de la asfixia derecha. La información detallada sobre este modelo animal fue publicad....
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Resultados
A continuación se describen los resultados representativos del panel de subconjuntos de monocitos y del panel de subconjuntos de células T.
La Figura 1 ilustra la estrategia jerárquica de gating para el panel de subconjuntos de monocitos en células inmunitarias recogidas de la médula ósea de animales tratados con DMM. La misma estrategia fue utilizada y verificada en todos los demás tipos de tejido. Al configurar el experimento, se determinó la tensión de área de .......
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Discusión
Los métodos descritos en este protocolo han sido diseñados y probados para identificar de forma fiable varios subconjuntos tanto de monocitos/macrofagos como de células T dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo murino de osteoartritis (OA). El protocolo actual se puede modificar fácilmente para investigar diferentes tipos de tejido u otros tipos de células mediante el intercambio de anticuerpos, y se puede utilizar para modelos murinos alternativos de OA. Al analizar otros .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Andrew Lim, Ph.D. y Giles Best, Ph.D. por su ayuda en la configuración del citómetro de flujo. Este proyecto fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) adjudicada a PH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| APC anti-ratón CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel T-Cell Tampón |
| Brillante Tampón Plus 1000Tst | BD | 566385 Tampones | |
| Viabilidad Fijable Tinción 510, 100 µ g | BD | 564406 | Panel de células T |
| Mancha de viabilidad fijable 510, 100 y micro; g | BD | 564406 | Panel de monocitos |
| Liberasa, Grado de Investigación | Roche | 5401127001 | Enzima para tejido sinovial |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µ g | BD | 564985 | Panel de monocitos |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 y micro; g | BD | 562454 | Panel de monocitos |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 y micro; g | BD | 742274 | panel de células T |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 y micro; g | BD | 565250 | Panel de monocitos |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 y micro; g | BD | 563061 | Panel de células T |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µ g | BD | 557596 | Panel de células T |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 y micro; g | BD | 552775 | Panel de células T |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 y micro; g | BD | 565480 | Panel de celdas T |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 y micro; g | BD | 565261 | Panel de células T |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 y micro; g | BD | 740664 | Panel de células T |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 y micro; g | BD | 563687 | Panel de monocitos |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 y micro; g | BD | 563332 | Panel de células T |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 y micro; g | BD | 565411 | Panel de monocitos |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µ g | BD | 560408 | Panel de células T |
| MS I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 y micro; g | BD | 563414 | Panel de monocitos |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ g | BD | 560593 | Panel de monocitos |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µ g | BD | 560600 | Panel de monocitos |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 y micro; g | BD | 564143 | Panel de células T |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 y micro; g | BD | 562894 | Panel de células T |
| Tampón de lisado de glóbulos rojos | N/A | /A | Tampones |
| de transcripción 100Tst | BD | 562574 Tampones |
Referencias
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H.
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