Цитометрия потока Анализ подмножества иммунных клеток в murine spleen, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани в модели остеоартрита
Summary
Здесь мы описываем подробный и воспроизводимый протокол цитометрии потока для выявления моноцитов/макрофагов и Т-клеточных подмножества с использованием как экстра-, так и внутриклеточного окрашивания анализов в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани, используя установленную хирургическую модель муринового остеоартрита.
Abstract
Остеоартрит (ОА) является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга, затрагивающих пациентов, страдающих от боли и физических ограничений. Последние данные свидетельствуют о потенциальном воспалительном компоненте заболевания, при этом Т-клетки и моноциты/макрофаги потенциально связаны с патогенезом ОА. Дальнейшие исследования постулировали важную роль подмножений обеих воспалительных клеточных линий, таких как Th1, Th2, Th17 и T-регулятивных лимфоцитов, а также макрофагов M1, M2 и синовиум-тканей-резидентов. Однако взаимодействие между локальной синовиальной и системной воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе неизвестно. Чтобы полностью понять, как Т-клетки и моноциты / макрофаги способствуют ОА, важно иметь возможность количественно определить эти клетки и их подмножества одновременно в синовиальной ткани, вторичных лимфатических органов и системно (селезенки и костного мозга). В настоящее время различные подмножества воспалительных клеток могут быть определены путем сочетания маркеров клеточной поверхности, что делает цитометрию многоцветного потока мощным методом в расследовании этих клеточных процессов. В этом протоколе мы описываем подробные шаги, касающиеся сбора урожая синовиальной ткани и вторичных лимфатических органов, а также генерации одноклеточных суспензий. Кроме того, мы представляем как внеклеточное окрашивание анализ для выявления моноцитов / макрофагов и их подмножего, а также экстра- и внутриклеточного окрашивания анализ для выявления Т-клеток и их подмножего в мурин селезенки, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован, в результате чего очень воспроизводимые анализы, которые могут быть использованы для других хирургических и нехирургических моделей ОА мыши.
Introduction
Остеоартрит (ОА) является изнурительным и болезненным заболеванием, включающим различные патологии всех тканей, связанных с суставом1. Затрагивающие примерно 3,8% мировогонаселения 2, ОА является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга и она станет 4-йведущей причиной инвалидности во всем мире к 2020году 3. Посттравматический ОА происходит после травмы сустава и составляет не менее 12% всех ОА и до 25% ОА в восприимчивых суставов, таких какколено 4,5. Кроме того, повреждение суставов увеличивает пожизненный риск ОА более чем в пять раз6. Не все травмы с явно аналогичной нестабильности будет продолжать развиваться ОА, и поэтому определяющие факторы, которые управляют долгосрочной ОА-риск остается сложной задачей. Это имеет решающее значение для того, чтобы разработать эффективные методы лечения для профилактики и / или лечения посттравматического ОА, для расследования и лучше определить травмы конкретных патологии, причины и механизмы, которые предрасполагают кОА 1.
ОА и его определяющее разрушение хряща ранее было полностью связано с механическим стрессом и, таким образом, ОА считалась невоспалительноезаболевание 2. Тем не менее, более поздние исследования показали воспалительное проникновение синовиальных мембран и увеличение воспалительных клеток в синовиальной ткани у пациентов с ОА посравнению со здоровыми контроля 2, проливая свет на воспалительный компонент в качестве потенциальной движущей силы в ОА. Дальнейшие исследования показали, что аномалии как в CD4 “и CD8” Т-клеточный профиль, а также моноцитов / макрофагов врожденной иммунной системы может способствовать патогенеза ОА2,7. Детальные исследования этих аномалий выявили соответствующие роли для различныхподмножей Т-клеток 2,таких как Th18,Th29,Th178 и T нормативных (Treg)популяций 10,11. Несмотря на это убедительные доказательства, причинно-следственная связь между изменением Т-клеток ответы и развитие и прогрессирование ОА до сих пор неизвестно2.
В дополнение к конкретным Т-клеток, имеющих роль в ОА, последние исследования показывают, что дифференцированно поляризованных / активированных макрофагов могут быть связаны с патогенезом ОА12. В частности, макрофаги, происходящие из моноцитов крови, накапливаются в синовии и поляризуются либо в классически активированные макрофаги (М1), либо в альтернативно активированные макрофаги (М2) во время развития ОА, подразумевая корреляцию между моноцитами, полученными макрофагами, иОА 13. В отличие от этого, некоторые подмножества макрофагов населяют органы на ранних стадиях развития и самостоятельно поддерживают их численность в моноците независимойматерии 14. Недавно, совместная защитная функция опосредованная плотно-развязным барьером была показана для этих синовиально-тканевых резидентов макрофагов (STRMs)14. Эти выводы свидетельствуют о том, что аномалии, в частности подмножества макрофагов, могут играть решающую роль при разработке ОА. Однако взаимодействие между этой воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе после травмы неизвестно.
Исторически анализ иммунных клеток в синовиальной ткани был ограничен иммуногистохимией (IHC) или экспрессией мРНК путем обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR)подходов 15,16. Однако и IHC, и RT-PCR не имеют возможности одновременно идентифицировать несколько различных типов клеток и их подмножего, что ограничивает применимость этих методов. Кроме того, IHC ограничивается анализом небольших образцов тканей и может пропустить очаговых воспалительных накоплений клеток. За последние несколько лет было разработано множество поверхностных маркеров для различных типов клеток, и подмножества иммунных клеток теперь могут быть надежно идентифицированы различными комбинациями этих маркеров. Благодаря устойчивому техническому прогрессу, цитометры потока теперь способны идентифицировать множество различных фторхромов, одновременно позволяющих анализ больших многоцветных панелей антител.
Цитометрия потока предоставляет следователям мощный метод, который позволяет одновременной идентификации и количественной оценки множества иммунных клеток и их подмножества на уровне одной клетки. Мы разработали и оптимизировали как внеклеточный анализ окрашивания для выявления моноцитов/макрофагов и их подмножестей, так и дополнительный/внутриклеточный анализ окрашивания для выявления Т-клеток и их подмножестей в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован в результате чего весьма воспроизводимые анализ, который может быть использован для других хирургических и нехирургических моделейОА мыши 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные в этом протоколе, были разработаны и протестированы для надежного выявления различных подмножей как из моноцитов / макрофагов и Т-клеток в селезенке мурина, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани в муриной модели остеоартрита (ОА). Текущий протокол м?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Эндрю Лим, доктор философии и Джайлс Бест, доктор философии за помощь в создании цитометра потока. Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1), присужденным PH.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
Referencias
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints–analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
