Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale
Summary
Descriviamo un’iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L’approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.
Abstract
Il protocollo qui descritto descrive come iniettare soluzioni in modo sicuro e manuale attraverso la cisterna magna, eliminando il rischio di danni al parenchyma sottostante. I protocolli pubblicati in precedenza raccomandano l’utilizzo di aghi dritti che devono essere abbassati a un massimo di 1-2 mm dalla superficie durale. L’improvviso calo di resistenza una volta che la membrana durale è stata forata rende difficile mantenere l’ago in una posizione costante. Il nostro metodo, invece, impiega un ago piegato alla punta che può essere stabilizzato contro l’osso occipitale del cranio, impedendo così alla siringa di penetrare nel tessuto dopo la perforazione della membrana durale. La procedura è semplice, riproducibile e non causa disagio duraturo negli animali operati. Descriviamo la strategia di iniezione intracisternale nel contesto della mappatura genetica del destino delle cellule leptomeningeali vascolari. La stessa tecnica può, inoltre, essere utilizzata per affrontare una vasta gamma di questioni di ricerca, come sondare il ruolo dei leptomeningi nel neurosviluppo e la diffusione della meningite batterica, attraverso l’ablazione genetica dei geni putativamente implicati in questi fenomeni. Inoltre, la procedura può essere combinata con un sistema di infusione automatizzato per una consegna costante e utilizzato per monitorare il movimento del fluido cerebrospinale tramite iniezione di molecole fluorescenti etichettate.
Introduction
Le cellule leptomeningeali sono una popolazione fibroblasta di cellule organizzate in uno strato sottile sovrapponendo il cervello ed esprimendo geni implicati nel crosslinking collagene (ad esempio, Dcn e Lum), e nella creazione di una barriera rompi-meningea (ad esempio, Cldn11)1,2. Le cellule leptomeningee sono implicate in una vasta gamma di funzioni fisiologiche, dal rigoroso controllo sul drenaggio del liquido cerebrospinale3 alla guida di progenitori neurali nel cervello in via di sviluppo4,5. Uno studio recente ha anche proposto che i leptomeningi nel neonato possano ospitare cellule radiali simili a glia che migrano nel parenchyma cerebrale e si sviluppano in neuroni corticali funzionali6.
Le cellule leptomeningealsi si trovano in prossimità di astrociti di superficie e condividere con loro, così come altri astroglia parenchymal, espressione di connexin-30 (Cx30)7. La procedura chirurgica descritta di seguito consente l’etichettatura diffusa e specifica di queste cellule meningee attraverso una consegna una tantum di endoxife nella cisterna magna di topi transgenici che esprimono condizionalmente tdTomato in Cx30– cellule (cioè, utilizzando un sistema CreER-loxP per la mappatura del destino). Endoxifen è un metabolita attivo del Tamoxifeen e induce la ricombinazione delle cellule che esprimono CreER allo stesso modo di Tamoxifen. È, tuttavia, la soluzione consigliata per l’applicazione topica perché si dissolve in 5-10% DMSO, invece di alte concentrazioni di etanolo. Inoltre, endoxifen non attraversa la barriera cervello-meningea, consentendo in tal modo una ricombinazione specifica delle cellule leptomeningeali, senza etichettatura della popolazione+ astrogliale sottostante (vedi Risultati rappresentativi).
La tecnica qui presentata mira a iniettare manualmente e in modo sicuro il composto nel liquido cerebrospinale, attraverso l’accesso diretto alla cisterna magna. A differenza di altre procedure più invasive che richiedono craniotomia, questo approccio consente di infondere composti senza causare danni al cranio o al parenchyma cerebrale. Pertanto, non è associato all’induzione di reazioni infiammatorie innescate dall’attivazione di cellule glia parenchychimiche. Simile ad altre strategie di iniezione descritte primadi 8,9,10, l’approccio attuale si basa sull’esposizione chirurgica della membrana durale atlanto-occipital che copre la cisterna magna, dopo una dissezione smussata dei muscoli del collo sovrapposti. Tuttavia, a differenza di altre procedure, si consiglia l’uso di un ago piegato sulla punta, che può essere stabilizzato contro l’osso occipitale durante la somministrazione. Ciò eviterà il rischio che l’ago penda troppo in profondità e danneggi il cervelletto sottostante e la medulla.
Questa procedura chirurgica è compatibile con le indagini di tracciamento del lignaggio che mirano a mappare i cambiamenti nelle identità cellulari e le rotte migratorie attraverso strati parenchyschi. Può anche essere adattato agli studi di ablazione genetica che intendono sondare il ruolo delle cellule leptomeningeali nella salute e nella malattia, come il loro contributo allo sviluppo corticale5 o la diffusione della meningite batterica3,11. Infine, può essere utilizzato per monitorare il movimento del fluido cerebrospinale quando combinato con la consegna di traccianti fluorescenti in animali selvatici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto presenta una procedura semplice e riproducibile per etichettare le cellule leptomeningeali per la mappatura del destino. Usiamo l’iniezione intracisternale di endoxife, un metabolita attivo di Tamoxifen, per indurre l’espressione del reporter fluorescente tdTomato in Cx30-CreER; Topo R26R-tdTomato12,13.
Rispetto ad altri protocolli utilizzati per ottenere l’accesso al liquido cerebrospinale attraverso la cis…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio svedese della ricerca, della Società svedese contro il cancro, della Fondazione svedese per la ricerca strategica, di Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse e del programma di ricerca strategica nelle cellule staminali e nella medicina rigenerativa presso l’Istituto Karolinska (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
Referencias
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