Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Summary

Apresentamos um método para investigar alterações osteoartríticas precoces no nível celular na cartilagem articular usando microscopia de força atômica (AFM).

Abstract

As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou osteoartrite (OA). A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma forte ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo forças em uma faixa tão pequena quanto o piconewton até o micronewton. As propriedades biomecânicas são de especial importância nos tecidos musculoesqueléticos, que são submetidos a altos níveis de tensão. AA como uma doença degenerativa da cartilagem resulta na ruptura da matriz pericelular (PcM) e no rearranjo espacial dos condrócitos incorporados em sua matriz extracelular (ECM). A interrupção no PCM e no ECM tem sido associada a alterações nas propriedades biomecânicas da cartilagem. No presente estudo utilizou-se a AFM para quantificar essas alterações em relação às mudanças específicas do padrão espacial dos condrócitos. A cada mudança de padrão, foram observadas mudanças significativas na elasticidade tanto para o PCM quanto para o ECM. Medir a elasticidade local permite, assim, tirar conclusões diretas sobre o grau de degeneração do tecido local em OA.

Introduction

Cartilagem articular é um tecido avascular, aneural. Os condrócitos pouco dispersos produzem, organizam e mantêm uma matriz extracelular expansiva (ECM) na qual estão incorporados. Como parte distinta e especializada do ECM, os condrócitos são cercados por uma fina camada de matriz especializada conhecida como matriz pericelular (PCM). O PCM atua como uma interface mecanosensível de matriz celular¹ que protege os condrócitos² e modula sua resposta biossintética³. Como descrito anteriormente⁴, na cartilagem saudável, os condrócitos são dispostos em padrões espaciais específicos e distintos que são específicos para cada camada tecidual e articulação^4,5 e dependem de mecanismos de carga mecânicos específicos da articulação⁶. Esses padrões mudam de pares e cordas em cartilagem saudável para cordas duplas com o início da osteoartrite (OA). Com a progressão da doença, os condrócitos formam pequenos aglomerados, aumentando gradualmente em tamanho para grandes aglomerados em OA avançado. Observa-se uma perda completa de qualquer estrutura organizacional e indução de apoptose no estágio final. Assim, o arranjo celular condrócito pode ser usado como um biomarcador baseado em imagem para progressão de OA⁴.

As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou OA. A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma poderosa ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo uma ampla gama de força, do piconewton ao micronewton. A principal aplicação da AFM é medir a topografia superficial e as propriedades mecânicas das amostras na resolução subnanômetro⁷. O dispositivo de medição consiste em três componentes principais: 1) Uma sonda AFM, que é uma ponta afiada montada em um cantilever e é usada para a interação direta com a superfície da amostra. Quando a força é aplicada ao cantilever, a deformação deste último ocorre de acordo com as propriedades do tecido medido. 2) Um sistema óptico que projeta um raio laser no cantilever, que é então refletido em uma unidade detectora. 3) Um detector de fotodiodo que capta a luz desviada do cantilever. Ele converte as informações recebidas sobre a deflexão do laser pelo cantilever em uma curva de força que pode ser analisada.

Assim, o princípio principal da AFM é a detecção da força atuando entre a sonda AFM e a estrutura-alvo da amostra. As curvas de força obtidas descrevem as propriedades mecânicas das estruturas-alvo na superfície da amostra como elasticidade, distribuição de carga, magnetização, estresse de rendimento e dinâmica de deformação plástica elástica⁸. Uma vantagem importante da AFM em relação a outras técnicas de imagem é que a AFM pode ser usada para medir as propriedades mecânicas das células vivas em médio ou tecido em um estado nativo sem danificar o tecido. A AFM pode operar tanto em condições líquidas quanto secas. Não há necessidade de preparação da amostra. A AFM oferece a possibilidade de visualizar um espécime e medir suas propriedades mecânicas simultaneamente em espécimes próximos a condições fisiológicas. No presente estudo descrevemos uma nova abordagem para avaliar a progressão da OA medindo a elasticidade do PCM e do ECM na cartilagem articular nativa. A correlação da organização espacial dos condrócitos com o grau de degeneração do tecido local fornece uma perspectiva completamente nova para a detecção precoce de OA. A relevância funcional desses padrões não foi avaliada até agora, no entanto. Como a principal função da cartilagem articular é o rolamento de carga em baixo atrito, o tecido deve possuir propriedades elásticas. A AFM permite medir não apenas a elasticidade do ECM, mas também os padrões celulares espaciais incorporados em seu PCM. A correlação observada de elasticidade com a mudança de padrão espacial dos condrócitos é tão forte que medir a elasticidade sozinha pode permitir a estratificação da degeneração do tecido local.

Moduli elástico do PCM e ECM foram avaliados em seções de 35 μm-thin utilizando um sistema AFM integrado em um microscópio de contraste de fase invertido que permitiu a visualização simultânea da amostra de cartilagem. Este protocolo baseia-se em um estudo já publicado em nosso laboratório⁹ e descreve especificamente como caracterizar o arranjo espacial dos condrócitos e como medir a elasticidade de seu PCM e ECM associados. A cada mudança de padrão dos condrócitos, mudanças significativas na elasticidade também podem ser observadas tanto para o PCM quanto para o ECM, permitindo que essa técnica seja usada para medir diretamente o estágio de degeneração da cartilagem.

Esta abordagem validada abre uma nova maneira de avaliar a progressão da OA e os efeitos terapêuticos em estágios iniciais antes que a degradação do tecido macroscópico realmente comece a aparecer. Realizar medições de AFM de forma consistente é um processo árduo. No protocolo a seguir descrevemos como preparar a amostra a ser medida pela AFM, como realizar as medições aftosas reais começando com a preparação do cantilever, como calibrar o AFM e, em seguida, como realizar as medições. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem clara e concisa para obter dados confiáveis e fornecer estratégias básicas para processá-los e interpretá-los. A seção de discussão também descreve as armadilhas mais comuns deste método rigoroso e fornece dicas úteis para solucionar problemas.

Protocol

As amostras de cartilagem humana foram obtidas de pacientes submetidos a artroplastia total do joelho no Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen, Alemanha, e no Hospital Winghofer, Rottenburg a.N., Alemanha, para o estágio final do joelho. A aprovação do comitê de ética departamental, institucional e local foi obtida antes do início do estudo (projeto nº 674/2016BO2). O consentimento informado por escrito foi recebido de todos os pacientes antes da participação. Os métodos f…

Representative Results

Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas, para pequenos e finalmente para grandes aglomerados, tanto ecm(Figura 3A) quanto PCM(Figura 3B)moduli elástico diminuiu significativamente entre cada mudança de padrão. A única exceção foi a diferença de ECM entre cordas e cordas duplas (p = 0,072). Os resultados mostram que a razão ECM/PCM (Figura 4B) não mudou significativamente, enquanto observou-se uma dimin…

Discussion

Utilizando a AFM como uma técnica nova e poderosa para medir as propriedades biomecânicas dos materiais biológicos em um nível de nanoescala, medimos as propriedades elásticas do ECM e do PCM na cartilagem articular osteoartrítica humana. As amostras de cartilagem foram selecionadas de acordo com seu padrão espacial predominante de organização de condrócitos como um biomarcador à base de imagem para degeneração tecidual local. Como esperado, observou-se forte declínio nos valores de elasticidade tanto do EC…

Materials

Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012