ب. ايروجينوسا مصابة 3D شارك الثقافة من الخلايا الظهارية القصبي و الضامة في واجهة الهواء السائل لتقييم ما قبل الإكلينيكي من المضادة للعدوى
Summary
نحن وصف بروتوكول لنموذج ثقافة ثلاثية الأبعاد المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، وذلك باستخدام CFBE41o– الخلايا، الضامة THP-1، وSوى pseudomonas aeruginosa،التي أنشئت في واجهة الهواء السائل. يوفر هذا النموذج منصة جديدة لاختبار فعالية المضادات الحيوية في وقت واحد، وظيفة الحاجز الظهاري، وعلامات الالتهاب.
Abstract
البحوث fDrug لعلاج التهابات الرئة تتقدم نحو النماذج التنبؤية في المختبر عالية التعقيد. يمكن أن يؤدي وجود البكتيريا متعددة الأوجه في نماذج الرئة إلى إعادة تكييف الترتيب الظهاري ، في حين تنسق الخلايا المناعية استجابة التهابية ضد البكتيريا في البيئة الدقيقة. بينما في نماذج الجسم الحي كانت الخيار لاختبار جديدة مضادة للعدوى في سياق التليف الكيسي، فإنها لا تزال لا تحاكي بدقة في الظروف في الجسم الحي من هذه الأمراض في البشر ونتائج العلاج. ويمكن لنماذج معقدة في المختبر من الشعب الهوائية المصابة على أساس الخلايا البشرية (الظهارية الشعب الهوائية و الضامة) ومسببات الأمراض ذات الصلة سد هذه الفجوة وتسهيل ترجمة جديدة لمكافحة العدوى في العيادة. لهذه الأغراض، تم إنشاء نموذج مشترك للثقافة من التليف الكيسي البشري القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o– و THP-1 monocyte المستمدة من الضامة، تقليد عدوى الغشاء المخاطي القصبي البشري من قبل P. aeruginosa في الهواء السائل واجهة (ALI) الظروف. تم إعداد هذا النموذج في سبعة أيام ، ويتم تقييم المعلمات التالية في وقت واحد: سلامة الحاجز الظهاري ، والهجرة الضامة ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية ، والالتهاب. ويصف هذا البروتوكول نظاما قويا ويمكن استنساخه لتقييم فعالية الأدوية والاستجابات المضيفة التي يمكن أن تكون ذات صلة باكتشاف مضادات جديدة للعدوى وتعظيم إيصالها للهباء الجوي إلى الرئتين.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa هو الممرض ذات الصلة في التليف الكيسي (CF) الذي يساهم في ضعف أنسجة الرئة1. إنتاج السكريات، مثل ألجينات وغيرها من exucoid exopolysaccharides، ينسق تقدم المرض، مما يؤدي إلى الالتزام البكتيري عنيد، يحد من تقديم المضادات الحيوية إلى البكتيريا ويحمي البكتيريا ضد الجهاز المناعي المضيف2. إن انتقال P. aeruginosa من مرحلة planktonic إلى تشكيل البيوفيلم مسألة حاسمة في هذا السياق ، مما يسهل أيضًا حدوث التسامح مع المضادات الحيوية.
في سياق CF، تم استخدام الفأرة في المقام الأول كنموذج. الفئران، ومع ذلك، لا تتطور تلقائيا هذا المرض مع إدخال الطفرات CF3. وقد أجريت معظم البكتيريا بيو فيلم التنمية والدراسات القابلية للأدوية على الأسطح غير الحيوية، مثل أطباق بيتري. غير أن هذا النهج لا يمثل التعقيدات الحيوية. على سبيل المثال، هناك حواجز بيولوجية مهمة غائبة، بما في ذلك الخلايا المناعية وكذلك ظهارة المخاطية. على الرغم من P. aeruginosa هو سامة جدا للخلايا الظهارية, وقد تمكنت بعض المجموعات للمشاركة في زراعة في وقت سابق P. aeruginosa بيو فيلم مع الخلايا القصبية البشرية. نشأت هذه الخلايا من مرضى التليف الكيسي مع طفرة CFTR (CFBE41o– الخلايا)4 وسمح لتقييم فعالية المضادات الحيوية5 أو تقييم تصحيح بروتين CFTR أثناء العدوى6. وقد تبين أن هذا النموذج لتحسين القدرة على التنبؤ بكفاءة المخدرات ، بالإضافة إلى تمكين توصيف القضايا مع الأدوية التي فشلت في المراحل اللاحقة من تطور المخدرات7.
ومع ذلك ، في الرئة ، يتعرض ظهارة المخاطية للهواء. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المناعية الموجودة في الشعب الهوائية، مثل الضامة الأنسجة، تلعب دورا أساسيا ضد مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات8. تهاجر الضامة عبر طبقات الخلايا المختلفة للوصول إلى تجويف الشعب الهوائية ومحاربة العدوى. وعلاوة على ذلك، الأدوية المستنشقة أيضا للتعامل مع وجود المخاط كعنصر إضافي غير الخلوية من حاجز الدم الهوائية الرئوي9. في الواقع، تم تطوير العديد من النماذج المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر، بهدف زيادة أهمية في الجسم الحي. ولا تزيد نظم الاستزراع المشترك من تعقيد نظم المختبرات لاكتشاف المخدرات فحسب، بل تمكن أيضا من دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية. وقد تم تناول هذا التعقيد في دراسات حول هجرة الضامة10، والافراج عن الببتيدات المضادة للميكروبات من قبل العدلات11، ودور المخاط في العدوى9، ورد فعل الخلية الظهارية للضرر المفرط12. ومع ذلك، يمكن الاعتماد عليها CF المصابة في المختبر نموذج الذي يتميز الطفرة الجينية في CF، التي تتعرض للهواء (زيادة الحالة الفسيولوجية)، ويدمج الخلايا المناعية لا تزال تفتقر.
ولسد هذه الفجوة، فإننا نصف بروتوكولاً لثقافة الإنسان المشتركة المستقرة ثلاثية الأبعاد في الخطوط الجوية المصابة. النموذج هو الذي يتألف من الخلايا الظهارية 5 والخلايا الضامة، المصابة بP. aeruginosa وقادرة على تمثيل كل من حاجز الانتشار والمناعية. بهدف اختبار مضادات العدوى في إنتاجية عالية إلى حد معقول، تم تأسيس هذه الثقافة المشتركة على غشاء فلتر نفاذي من إدراج لوحة جيدا، وذلك باستخدام اثنين من خطوط الخلايا البشرية: CFBE41o– و THP-1 monocyte المشتقة من الضامة. وعلاوة على ذلك، لدراسة ترسب الهباء الجوي المضادللعدوى 13،تم إنشاء النموذج في واجهة الهواء السائل (ALI) بدلاً من الظروف المغطاة السائلة (LCC).
كما نحن التقرير هنا, هذا النموذج يسمح بتقييم البقاء على قيد الحياة ليس فقط البكتيرية على العلاج بالمضادات الحيوية ولكن أيضا السمية الخلوية الخلية, سلامة الحاجز الظهارية, الهجرة عبر الضامة, والاستجابات الالتهابية, التي هي معلمات أساسية لتطوير المخدرات.
يجمع هذا البروتوكول بين نوعين من الخلايا ذات الصلة لعلاج استنشاق الشعب الهوائية الرئوية: الضامة وظهارة الشعب الهوائية CF. وتُزرع هذه الخلايا على طرفي نقيض من إدراجات الدعم القابلة للنفاذ، مما يسمح بتعرض الخلايا للهواء (وتسمى ظروف الواجهة الهوائية السائلة (ALI). هذه الثقافة المشتركة للخلايا المضيفة المصابة في وقت لاحق مع P. aeruginosa. كلا خطوط الخلية المضيفة هي من أصل الإنسان: الخلايا الظهارية تمثل ظهارة الشعب الهوائية التليف الكيسي، مع طفرة على قناة CF (CFBE41o–) ، وخلايا THP-114 هي خط خلية تشبه الضامة. يسمح لأول مرة لطبقة ظهارية التقاء لتشكيل على الجانب العلوي من إدراج لوحة جيدا قبل أن تضاف الخلايا الضامة مثل إلى المقصورة المقابلة. بمجرد تأسيس الثقافة المشتركة في ALI ، يتم تلقيح النظام مع P. aeruginosa على الجانب apical. ثم يتم استخدام هذا النظام المصاب المشترك في الثقافة لتقييم فعالية المضادات الحيوية، مثل التوسرامايسين. يتم تحليل نقاط النهاية التالية: سلامة الحاجز الظهاري من حيث المقاومة الكهربائية عبر الطرفية (TEER) ، والتصور لتفاعلات الخلايا الخلوية والبكتيريا بواسطة المجهر المسح الضوئي بالليزر (CLSM) ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية من خلال عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) ، والبقاء على قيد الحياة الخلية المضيفة (السمية الخلوية) وإطلاق سراح السيتوكين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الورقة يصف بروتوكول لثقافة 3D المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، التي شكلتها الإنسان التليف الكيسي القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o- والإنسان أحادية الخلية المشتقة خط الخلية THP-1. البروتوكول يسمح بتقييم سلامة الحاجز الظهاري, هجرة الضامة, بقاء البكتيريا, والتهاب, التي هي معايير هامة عند …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى هذا العمل تمويلاً من برنامج آفاق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي بموجب اتفاقية منحة رقم 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – تصميم وتطوير التقانات النانوية المتقدمة للتغلب على الحواجز البيولوجية ومعالجة الأمراض الشديدة. نشكر الدكتورة آنا كوستا والدكتورة جيني جونتك على الدعم الكبير في تطوير الثقافة المشتركة، أولغا هارتفيغ، للتوضيح العلمي، أنيا هونكر، لـ ELISA، بترا كونيغ، جانا ويستهويس والدكتورة كيارا دي روسي على الدعم على ثقافة الخلية، والتحليلات، والمجهر. كما نشكر تشيلسي ثورن على تدقيق مخطوطتنا.
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
Referencias
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution – A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis – where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O’Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
