שימוש במגנטומטריה לניטור התאגדות תאית והתפרקות ביולוגית של חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתטיים כימית
Summary
חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים באמצעות הליך ג’ל סול לא רקיקי ומצוידים במולקולות קצרות אניוניות או פולימר. השימוש מגנטומטריה לניטור התאגדות ו biotransformations של חלקיקים מגנטיים בתוך תאי גזע אנושיים מודגם באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM).
Abstract
חלקיקים מגנטיים, עשוי תחמוצת ברזל, מציגים עניין מוזר עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים שעבורם הם מופנמים לעתים קרובות בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים. אתגר אחד הוא להעריך את גורלם בסביבה תאית עם מתודולוגיות אמינות ומדויקות. בזאת, אנו מציגים את השימוש מגנטומטר מדגם רוטט (VSM) כדי לכמת במדויק את השלמות של חלקיקים מגנטיים בתוך התאים על ידי מדידת הרגע המגנטי שלהם. תאי גזע מסומנים לראשונה עם שני סוגים של חלקיקים מגנטיים; חלקיקים יש את אותה הליבה המיוצר באמצעות סינתזה מהירה ויעילה מבוססי מיקרוגל nonaqueous סול ג’ל ושונים בציפוי שלהם: מולקולת חומצת לימון נפוץ מושווה חומצה פוליאקרילית. היווצרות של ספירואידים תאים 3D מושגת לאחר מכן באמצעות צנטריפוגה ואת הרגע המגנטי של כדוריות אלה נמדד בזמנים שונים עם VSM. הרגע המתקבל הוא טביעת אצבע ישירה של שלמות הננו-חלקיקים, עם ערכים יורדים המעידים על השפלה של חלקיקים. עבור שני הננו-חלקיקים, הרגע המגנטי פוחת עם הזמן התרבותי וחושף את ההתכלה שלהם. השפעה מגנה של ציפוי חומצה פוליאקרילית מוצג גם, בהשוואה לחומצה ציטרית.
Introduction
יש עניין מוגבר בתכונות המגנטיות של חלקיקי תחמוצת ברזל עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים. התגובה שלהם תהודה מגנטית עושה אותם סוכני ניגודיות אמינים עבור הדמיית תהודה מגנטית (MRI), יתרון ברפואה רגנרטיבית שבו תאים המסומנים עם חלקיקים מגנטיים ניתן לעקוב ב vivo לאחר ההשתלה1. באמצעות שדות מגנטיים, תאים יכולים גם להיות מונחים במרחק; בדרך זו, spheroids הסלולר2,3, טבעות4, אוגיליונות 5 ניתן להנדס מגנטי וגם מגורה מרחוק6, נכס בפיתוח של רקמות ללא פיגומים. מגוון האפשרויות עבור חלקיקים אלה כולל גם מערכות משלוח תרופות7,8 וטיפול היפרתרמי מגנטי פוטואין להרוג תאים סרטניים9,10,11. עבור כל היישומים האלה, חלקיקים משולבים בסביבה הביולוגית או על ידי הזרקה תוך ורידי או באמצעות הפנמה ישירה בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים, אשר מטיל ספק גורלם תאיים.
בניתוחי vivo נמסרה הבנה כללית של גורל הננו-חלקיקים באורגניזם: עם הזרקת זרם הדם, הם נלכדים לראשונה בעיקר על ידי מקרופאגים של הכבד (תאי קופפר), טחול ומח עצם, מתפרקים בהדרגה, ומצטרפים לבריכת הברזל של האורגניזם12,13,14,15,16,17,18,19. תצפיות איכותיות אפשריות רק בשל זרימת הננו-חלקיקים ברחבי האורגניזם. בדרך כלל, העברת מיקרוסקופ אלקטרונית (TEM) ניתן להשתמש כדי לצפות ישירות את חלקיקים ואת נוכחותו של ברזל באיברים ניתן לקבוע באמצעות מינון. לאחרונה, גורלם הוערך ישירות על מאגר של תאים, כלומר במעגל קרוב ללא בריחה ברזל, המאפשר מדידה כמותית של biotransformations שלהם ברמת התא20,21,22. מדידות כאלה אפשריות באמצעות ניתוח התכונות המגנטיות של הננו-חלקיקים הקשורים קשר הדוק לשלמות המבנית שלהם. מגנטומטריה מדגם רוטט (VSM) היא טכניקה שבה המדגם רוטט מעת לעת, כך מדידת הסליל של השטף המושרה מספק את הרגע המגנטי של המדגם בשדה המגנטי להחיל. זיהוי סינכרוני כזה מאפשר מדידה מהירה, המהווה נכס לקביעת הרגעים המגנטיים של מספר רב של דגימות20,21,22,23. החתימה המגנטית המקרוסקופית שאוחזרה על ידי VSM נותנת סקירה כמותית של כל המדגם הביולוגי בקורלציה ישירה לגודל ולמבנה של הננו-חלקיקים. בפרט, הוא מספק את הרגע המגנטי ברוויה (לידי ביטוי אמו) של הדגימות, שהוא כימות ישיר של מספר חלקיקים מגנטיים הנמצאים במדגם, בהתאמה לתכונות המגנטיות הספציפיות שלהם.
הוכח כי העיבוד תאיים של חלקיקים מגנטיים קשורה קשר הדוק לתכונות המבניות שלהם20. ניתן לשלוט בתכונות אלה באמצעות פרוטוקולי סינתזה אופטימליים. כל פרוטוקול מציג יתרונות ומגבלות. חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים בדרך כלל בתמיסות מימיות באמצעות coprecipitation של יוני ברזל24. כדי להתגבר על המגבלות של polydispersity גודל חלקיקים, שיטות סינתזה אחרות כגון שיטות סול-ג’ל בתיווך פוליול פותחו25. גישות nonaqueous על ידי פירוק תרמי מוביל לייצור של חלקיקי תחמוצת ברזל מכויל היטב26. עם זאת, השימוש בכמויות עצומות של פעילי שטח כמו אוליאמין או חומצה אולאית מסבך את הפונקציונליזציה שלהם ואת העברת המים עבור יישומים ביו-רפואיים. מסיבה זו, אנו לסנתז חלקיקים מגנטיים כאלה דרך מסלול ג’ל סול nonaqueous המוביל גבישות גבוהה, טוהר רבייה27. פרוטוקול זה מייצר חלקיקי גודל מבוקרים היטב שניתן לכוונן באמצעות וריאציית טמפרטורה28. עם זאת, מסלול סול-ג’ל לא מימי בסיוע מיקרוגל יש מגבלת גודל עליון של חלקיקים המתקבלים של סביב 12 ננומטר. הליך זה לא יותאם ליישומים המשתמשים בחלקיקים פרומגנטיים בטמפרטורת החדר. בנוסף לסינתזת הליבה, תכונה עיקרית נוספת שיש לקחת בחשבון היא הציפוי. שוכב על פני השטח של חלקיק, הציפוי פועל כמולקולה עיגון, עוזר הפנמה ממוקדת של חלקיקים, או שזה יכול להגן על חלקיק מפני השפלה. מאז בנזיל אלכוהול משמש כמקור חמצן ליגנד באותו זמן, חלקיקים חשופים מיוצרים ללא צורך פעילי שטח נוספים או ליגנדים. חלקיקים לאחר מכן בקלות פני השטח פונקציונלי לאחר סינתזה ללא תהליך חילופי פעילי שטח.
בזאת, שני סוגים של חלקיקים מוערכים בעלי אותה ליבה ושונים בציפוי. הליבה מסונתזת בטכניקה מהירה ויעילה ביותר המבוססת על מיקרוגל. שני הציפויים בהשוואה מורכבים מחומצת לימון, אחד הנפוצים ביותר כסוכן ציפוי ביישומיםביו-רפואיים 29,30, וחומצה פוליאקרילית (PAA), ציפוי פולימרי עם מספר גבוה של פונקציות כלאט. מדידות מגנטומטריה VSM משמשים לאחר מכן תחילה כדי לכמת את ספיגת הננו-חלקיקים על ידי התאים, ולאחר מכן כהערכה ישירה של השלמות המבנית הננו-חלקיקית עם הפנמה בתאי גזע. התוצאות מראות כי ריכוז הדגירה משפיע על ספיגת הננו-חלקיקים וכי הציפוי משפיע על השפלתם, כאשר המספר הגדול של מולקולות עיגון של PAA מגינות על הליבה מפני השפלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות סינתזה מהירה ויעילה המבוססת על מיקרוגל, ניתן לסנתז בקלות חלקיקים מגנטיים, עם גודל מבוקר, ומצופים עוד יותר במולקולות נתונות. צעד קריטי הוא למלא את מלח הברזל ואת אלכוהול בנזיל תחת ואקום כדי לשמור על פיזור קטן בגודל. אלכוהול בנזיל פועל הן כמו ממס ו ligand באותו זמן המאפשר ישירות להשיג תחמ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (ERC-2014-CoG פרויקט MaTissE #648779). המחברים רוצים להכיר פלטפורמת אפיונים פיזיו-כימיים CNanoMat של אוניברסיטת פריז 13.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
Referencias
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the “hot-spot” effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles – The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
