הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.
גרורות, הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה עבור רוב חולי הסרטן, יכול להיות מאתגר למודל פרה-אקליני בעכברים. מעט מודלים ספונטניים של גרורות זמינים. לכן, מודל גרורות ניסיוני מעורבים הזרקת וריד זנב של קווי תאים מתאימים הוא עמוד התווך של מחקר גרורות. כאשר תאים סרטניים מוזרקים לווריד הזנב לרוחב, הריאה היא האתר המועדף עליהם של קולוניזציה. מגבלה פוטנציאלית של טכניקה זו היא כימות מדויק של נטל גידול הריאות גרורתי. בעוד כמה חוקרים לספור macrometastases של גודל מוגדר מראש ו / או לכלול micrometastases בעקבות חתך של רקמות, אחרים קובעים את האזור של נגעים גרורתיים ביחס לאזור הרקמה הרגיל. שתי שיטות הכימות האלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר הנטל גרורתי גבוה. להלן, אנו מדגימים מודל הזרקה תוך ורידי של גרורות ריאות ואחריו שיטה מתקדמת לכימות נטל הגידול גרורתי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תהליך זה מאפשר לחקור פרמטרים מרובים של נקודת קצה, כולל גודל גרורות ממוצע, מספר גרורות כולל ואזור גרורות כולל, כדי לספק ניתוח מקיף. יתר על כן, שיטה זו נבדקה על ידי לוח פתולוג וטרינרי מוסמך על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים (SEK) כדי להבטיח דיוק.
למרות היותו תהליך מורכב מאוד ולא יעיל1, גרורות הוא תורם משמעותי לתחלואה ותמותה של חולי סרטן2. למעשה, רוב מקרי המוות הקשורים לסרטן מיוחסים להתפשטות גרורתית של מחלות3,4. על מנת שתאי הגידול יצאו גרורות בהצלחה, עליהם להתנתק מהאתר הראשי, לפלוש דרך סטרומה סמוכה, לחדור למחזור הדם או ללימפטיקה, לנסוע למיטה נימית של אתר משני, להזרים לרקמה המשנית, ולהתרבות או לגדול כדי ליצור נגעים גרורתיים5. השימוש במודלים של עכברים היה קריטי לקידום ההבנה של המנגנונים המולקולריים האחראים על זריעה גרורתית וצמיחה6,7. כאן, אנו מתמקדים גרורות סרטן השד, אשר הן מודלים עכבר מהונדסים גנטית, כמו גם שיטות השתלה משמשים לעתים קרובות – כל אחד עם סט משלהם של יתרונות ומגבלות.
מודלים של גידולי החלב מהונדסים גנטית עושים שימוש ביזמים ספציפיים לבלוטת החלב, כולל MMTV-LTR (חוזרים על טרמינל ארוך של וירוס החלב של העכבר) ו– WAP (חלבון חומצי מי גבינה), כדי להניע ביטוי של טרנסג’נים באפיתל החלב8. אונקוגנס כולל אנטיגן T בינוני פוליומה (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1, ווירוס simian 40 (SV40) באו לידי ביטוי באופן זה9,10,11,12,13, ובעוד מודלים גנטיים אלה שימושיים לחקר חניכת גידול ראשוני והתקדמות, מעטים בקלות גרורות לאיברים רחוקים. יתר על כן, מודלים אלה של עכבר גנטי הם לעתים קרובות יותר זמן ועלות אוסרת מאשר מודלים גרורות ספונטניות או ניסיוניות. בהתחשב בהגבלתם של רוב המודלים של גידולי האם מהונדסים גנטית לחקר גרורות, טכניקות השתלה הפכו לשיטות אטרקטיביות לחקר תהליך מורכב זה. זה כולל אורתוטופיה, וריד זנב, תוך לב, הזרקה תוך גולגולתית של קווי תאים מתאימים.
למרות מספר שורות תא סרטן השד בקלות גרורות בעקבות הזרקה אורתוטופית לתוך כרית שומן חלב14,15, עקביות ושחזור של נטל הגידול גרורתי יכול להיות אתגר, ואת משך המחקרים האלה יכול להיות בסדר של מספר חודשים. להערכת גרורות ריאות, בפרט, הזרקה תוך ורידי לתוך הווריד הזנב היא לעתים קרובות שיטה לשחזור ויעילה יותר עם התפשטות גרורתית המתרחשת בדרך כלל בתוך טווח של כמה שבועות. עם זאת, מאז מודל הזרקה תוך ורידי עוקף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי, יש לנקוט זהירות בפירוש התוצאות של מחקרים אלה. בהדגמה זו, אנו מראים הזרקת וריד זנב של תאי גידול מאמרי יחד עם שיטת ניתוח מדויקת ומקיפה.
למרות שקהילת המחקר התקדמה משמעותית בהבנת התהליך המורכב של גרורות סרטן השד, ההערכה היא כי מעל 150,000 נשים יש כיום סרטן שד גרורתי16. מתוך אלה עם סרטן השד בשלב IV, >36% מהחולים יש גרורות ריאות17; עם זאת, התבנית הספציפית לאתר והשכיחות של גרורות יכולות להשתנות בהתאם לתת-סוג מולקולרי18,19,20,21. חולים עם גרורות ריאות הקשורות לסרטן השד יש הישרדות חציונית של רק 21 חודשים המדגיש את הצורך לזהות טיפולים יעילים סמנים ביולוגיים חדשניים עבור מחלה זו17. השימוש במודלים גרורתיים ניסיוניים, כולל הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים, ימשיך לקדם את הידע שלנו על אתגר קליני חשוב זה. בשילוב עם פתולוגיה הדמיה דיגיטלית ואת השיטה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי המתואר בפרוטוקול זה, זריקות וריד זנב הם כלי רב ערך לחקר גרורות סרטן השד.
ככל שהחוקרים ממשיכים להשתמש בהזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים כמודל ניסיוני לגרורות, חסרים פרקטיקות סטנדרטיות לניתוח נטל הגידול גרורתי שנוצר. במקרים מסוימים, הבדלים משמעותיים בנטל הגידול גרורתי על מניפולציה של קווי תאים מסוימים ו /או שימוש בתרכובות כימיות ניתן לראות מקרוסקופית. עם זאת, במ…
The authors have nothing to disclose.
הנתונים הייצוגית מומנו באמצעות המכון הלאומי לסרטן (K22CA218549 ל- S.T.S). בנוסף לסיועם בפיתוח שיטת הניתוח המקיפה המדווחת כאן, אנו מודים למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת אוהיו ולמשאב המשותף של פנוטיפינג עכבר (מנהל – קריסטה לה פרל, DVM, PhD) על שירותי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה ולליבת ההדמיה הפתולוגית לפיתוח וניתוח אלגוריתמים.
alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |