Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe
Summary
Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.
Abstract
La modulation optogénétique des sous-populations de neurones dans le cerveau a permis aux chercheurs de disséquer des circuits neuronaux in vivo et ex vivo. Cela fournit une prémisse pour déterminer le rôle des types de neurones dans un circuit neuronal et leur importance dans le codage de l’information par rapport à l’apprentissage. De même, la méthode peut être utilisée pour tester la signification physiologique de deux ou plusieurs régions cérébrales connectées chez les animaux éveillés et anesthésiés. La présente étude démontre comment les neurones de glutamate VTA modulent la vitesse de déclenchement des neurones pyramidaux putatifs dans le CA1 (hippocampe) des souris anesthésisées. Ce protocole utilise le profilage dépendant du virus adéno-associé (AAV) des neurones du glutamate VTA pour le traçage des terminaux de glutamate présynaptique VTA dans les couches de l’hippocampe. L’expression de l’opsine contrôlée par la lumière (channelrhodopsine; hChR2) et de la protéine de fluorescence (eYFP) hébergée par le vecteur AAV a permis le traçage antérograde des terminaux de glutamate VTA et la photostimulation des corps cellulaires des neurones du glutamate VTA (dans le VTA). Des électrodes de silicium aigu à haute impédance ont été positionnées dans le CA1 pour détecter les réponses multi-unités et uni-unités à la photostimulation VTA in vivo. Les résultats de cette étude démontrent la distribution dépendante de la couche des terminaux de glutamate VTA présynaptiques dans l’hippocampe (CA1, CA3 et DG). En outre, la photostimulation des neurones de glutamate VTA a augmenté le taux de déclenchement et d’éclatement des unités pyramidales CA1 putatives in vivo.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, un ensemble d’outils génétiques a été développé pour augmenter la spécificité de la modulation de type neurone et la cartographie des réseaux neuronaux complexes1. Notamment, des virus neurotropes ayant une capacité inhérente à infecter et à se répliquer dans les cellules neuronales ont été déployés pour exprimer ou ablater des protéines spécifiques dans des sous-types de neurones. Lorsqu’ils hébergent des protéines de fluorescence ou des indicateurs d’activité synaptique génétiquement codés, les vecteurs AAV transfectés marquent et délimitent les réseaux neuronaux dans les régions du cerveau2,3. Le choix d’un promoteur dans la construction AAV dirige l’expression du vecteur dans les types de neurones avec un certain niveau de spécificité (expressiondépendante du promoteur). Cependant, grâce à la recombinaison Cre-lox, les constructions AAV sont déployées avec une plus grande spécificité pour le labeling desneurones4, 5,6,7. Il convient de noter que les opsines microbiennes photoactivées et les protéines de fluorescence emballées dans des vecteurs AAV peuvent être exprimées dans divers sous-types de neurones8et sont idéales pour l’imagerie, le traçage de circuits de type neurone et la photomodulation9,10.
Les constructions AAV injectées stéréotacment dans une région du cerveau (ou noyau) entraînent l’expression de la protéine rapporteure dans les terminaux soma, dendrite et axones. L’expression neuronale de l’AAV hébergeant un gène rapporteur (eYFP) facilite le profilage des corps cellulaires des neurones et le traçage anatomique des projections vers et depuis d’autres régions du cerveau11,12,13,14. Les constructions AAV-eYFP transportant des opsines contrôlées par la lumière (par exemple, hChR2), peuvent être déployées comme un outil pour l’imagerie6,15 et le traçage physiologique basé sur la stimulation des projections neuronales pour cibler les zones du cerveau in vivo16. Selon le sérotype de l’AAV, la direction du profilage des neurones peut être antérograde ou rétrograde11,12. Des études antérieures ont établi que l’AAV5 se déplace antérogradement dans les neurones12. Ainsi, la photostimulation des corps cellulaires exprimant hChR2 produit des effets présynaptiques ailleurs dans le cerveau (cible)17.
Ici, l’AAV (sérotype 5) avec un promoteur CaMKIIα a été utilisé pour exprimer eYFP (reporter) et hChR2 (opsine) dans les neurones du glutamate VTA et les projections axonales. Les résultats de cette étude démontrent la distribution dépendante de la couche des terminaux présynaptiques VTA-glutamate dans les régions hippocampiques CA1, CA3 et DG. En outre, la photostimulation des neurones de glutamate VTA a augmenté les taux de déclenchement CA1 multi-unités et uni-unités in vivo par rapport aux valeurs de base. Ce protocole utilise des outils abordables et des logiciels disponibles dans le commerce qui peuvent augmenter la qualité des données obtenues à partir d’expériences de traçage de circuits neuronaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de la dernière décennie, la conception des constructions AAV a considérablement progressé. En tant que tels, plus de promoteurs spécifiques aux neurones ont été incorporés dans un ensemble de sérotypes AAV pour améliorer la spécificité de transfection14. En combinant des gènes pour les protéines de fluorescence, les transporteurs, les récepteurs et les canaux ioniques, des bibliothèques d’AAV existent maintenant pour l’imagerie, la neuromodulation et la détection de l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par la subvention de transition de la SCS accordée à OOM. OOM, PAA et AS ont conçu l’étude et effectué les expériences. AS et PAA ont analysé les résultats. OOM et PAA ont préparé le manuscrit. Nous remercions le Dr Karl Disseroth (Université de Stanford) d’avoir mis l’AAV à notre disposition.
Materials
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | |||
| Intan Recording Controller | |||
| Neuroexplorer | |||
| Plexon Offline Spike Sorter | |||
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
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