Proteolytisch afgebroken alginaat hydrogels en hydrofobe microbioreactoren voor porcine Oocyte Inkapseling
Summary
Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC’s) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.
Abstract
In de reproductieve biologie leidde de biotechnologierevolutie die begon met kunstmatige inseminatie en embryotransfertechnologie tot de ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals eicel in vitro rijping (IVM), in vitro fertilisatie (IVF) en klonen van huisdieren door nucleaire overdracht van somatische cel. IVM is de methode in het bijzonder van betekenis. Het is het platform technologie voor de levering van volwassen, goede kwaliteit eicellen voor toepassingen zoals vermindering van de generatie interval in commercieel belangrijke of bedreigde soorten, onderzoek met betrekking tot in vitro menselijke voortplanting, en de productie van transgene dieren voor celtherapieën. De term eicelkwaliteit omvat haar competentie om rijping te voltooien, te bevruchten, wat resulteert in gezonde nakomelingen. Dit betekent dat eicellen van goede kwaliteit van het grootste belang zijn voor een succesvolle bevruchting, waaronder IVF-procedures. Dit levert veel problemen op om een betrouwbare cultuurmethode te ontwikkelen die niet alleen de groei van menselijke eicellen, maar ook van andere grote zoogdiersoorten zou ondersteunen. De eerste stap in IVM is de in vitro cultuur van eicellen. Dit werk beschrijft twee protocollen voor de 3D-cultuur van varkensocyten. In het eerste, 3D-model cumulus-eicellen complexen (COCs) zijn ingekapseld in een fibrin-alginaat kraal tussendoordtreting netwerk, waarin een mengsel van fibrine en alginaat gelijktijdig worden gelled. In de tweede worden COC’s opgehangen in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes om microbiobioreactoren te vormen gedefinieerd als Vloeibare Knikkers (LM). Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, waardoor het behoud van de functionele relatie tussen de eicellen, en de omliggende folliculaire cellen.
Introduction
De ontwikkeling van verschillende cultuursystemen, waaronder driedimensionale (3D) systemen, heeft tot doel optimale omstandigheden te bieden voor de groei en rijping van eicellen geïsoleerd van de follikels, zelfs in de vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is van groot belang voor geassisteerde voortplantingstechnieken (ART), vooral met het oog op het toenemende aantal vrouwen die worstelen met onvruchtbaarheid na de behandeling van kanker1. Rijping van eicellen in in vitro omstandigheden (IVM) is al een gevestigde techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor de productie van in vitro embryo’s voor de voortplanting van vee2. Bij de meeste zoogdiersoorten kan echter, zelfs als er hoge rijpingspercentages van cumulus-eicellencomplexen (COC’s) kunnen worden bereikt (bereik 60 tot 90 %)3, hun ontwikkelingsbevoegdheid nog steeds niet aan de behoeften voldoen. Dit komt omdat de ontwikkeling van de zygotes verkregen op een zodanige wijze zelfs tot de blastocyst stadium is laag en na de overdracht in surrogaat dieren hun levensvatbaarheid tot termijn wordt verminderd. Daarom is het nodig de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo’s die zijn verkregen uit eicellen die onder de IVM-procedure4zijn onderworpen , te vergroten . Daarom worden nieuwe rijpingsmedia5 ontwikkeld en verschillende perioden van in vitrocultuur worden getest6,7 samen met suppletie van cultuurmedia met verschillende groeifactoren en moleculen8,9.
De eerste stap van elk compleet IVM-systeem is het creëren van optimale voorwaarden voor duurzame groei van eicellen tijdens de in vitro cultuur. De eicelgroei is een van de specifieke indicatoren van het vermogen van de eicel om meiose10,11te hervatten . Bovendien moet een passend eicel in vitrocultuursysteem in staat zijn zijn nucleaire rijping en cytoplasmatische differentiatie te ondersteunen12. De morfologie van het cumulus-eicelcomplex is een andere belangrijke indicator die in ART-klinieken wordt gebruikt om de beste eicel te selecteren voor latere stappen van in vitro fertilisatie (IVF) procedure bij mensen en vee12,13. Onder morfologische kenmerken van COCs beschouwd zijn: de eiceldiameter, de cytoplasma granulatie en de eerste poollichaam integriteit14,15. Bovendien is het oocyte ontwikkelingspotentieel gecorreleerd aan het uiterlijk en de verdichting van cumuluscellen en het aantal van hun lagen rond de eicel. Zeer belangrijk voor de juiste eicel in vitro cultuur systeem is ook het behoud van eicel-cumulus cellen juiste interacties en cytoskeleton stabiliteit16,17,18,19. Tot nu toe is in vitro oocyte groei binnen menselijke COC’s aangetoond20. Het gebruik van koe COCs resulteerde ook in levende geboorten. Deze werden geïsoleerd van onrijpe eierstokzakjes en vervolgens gekweekt voor 14 dagen tot de eicel was voldoende groot om de IVF-procedure21ondergaan . Op dezelfde manier leverden COC’s geïsoleerd van bavianenanonielen, onderworpen aan IVM na in vitrocultuur, eicellen op die meiose konden herinitieren in het stadium van de metafase II met een normaal verschijnende spindelstructuur22. Echter, in deze studie de auteurs niet proberen om ze te bevruchten. Niettemin wijzen dergelijke resultaten erop dat een soortgelijke procedure niet alleen kan worden toegepast op deze specifieke zoogdiersoorten, maar ook op menselijke cumulus-eicellencomplexen verkregen uit follikels die het mogelijk zouden moeten maken om eicellen van goede kwaliteit te verkrijgen die geschikt zijn voor een succesvolle IVF-techniek.
De hierboven beschreven resultaten werden verkregen met de toepassing van conventionele IVM-protocollen waarbij eicellen werden gekweekt in tweedimensionale (2D) systemen. De routineprocedure in 2D-kweeksystemen omvat eicellen, ondergedompeld in een druppel van een geschikte cultuurmedia, met minerale olie23,24. Aangenomen wordt dat een olieoverlay tijdens de in vitro oocytecultuur dient om vloeibare verdamping te voorkomen, waardoor het behoud van een goede pH en osmotische druk in de cultuur wordt gewaarborgd. Hoewel een dergelijk 2D-kweeksysteem het mogelijk maakt om, zelfs tot 87% van de rijpe varkensoocyten25,te verkrijgen, is bewezen dat de overlay van minerale olie een aanzienlijke verspreiding van lipoïde oplosbare materialen veroorzaakt die nodig zijn voor een goede ontwikkeling van eicellen26. Bovendien, als gevolg van steroïden (progesteron en oestrogenen) diffusie in de minerale olie tijdens eicelcultuur, een vertraging van nucleaire rijping en vermindering van de ontwikkelingscompetentie prestatie van varkens eicellen werd waargenomen. Dit kan leiden tot het verkrijgen van een klein aantal zygotes, die bovendien worden gekenmerkt door een lage ontwikkelingscapaciteit tot het stadium van de blastocyst en door een slechte levensvatbaarheid na overdracht in ontvangende dieren27. Daarom wordt getracht de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo’s die zijn afgeleid van eicellen die na de IVM-procedure zijn ontvangen, te vergroten door optimale voorwaarden te scheppen voor het bereiken van zowel cytoplasmatische als nucleaire rijpheid van eicellen die samen met CCs als complexen worden gekweekt, met name met behulp van driedimensionale (3D)-systemen. In de afgelopen tweedecennia,zijn verschillende innovatieve 3D-in-vitrocultuursystemenontwikkeld. Deze werden ontworpen om de natuurlijke ruimtelijke organisatie van cellen te behouden en om te voorkomen dat hun afvlakking in cultuurgerechten wat niet kan worden bereikt in de traditionele 2D-culturen. De structurele en functionele activiteit van gekweekte COC’s kan worden gewaarborgd door het behoud van hun goede architectuur en ongestoorde communicatie via gap-junctions tussen verschillende compartimenten30. De geschiktheid van bio-steigers voor 3D in vitro cultuur van cumulus-eicellen complexen is geëvalueerd met behulp van natuurlijke biomaterialen, zoals verschillende componenten van de extracellulaire matrix (ECM; collageen en hyaluronzuur)31 of inerte polymeren (alginaat)32. Deze pogingen getest in verschillende soorten bracht veelbelovende resultaten in termen van eicel meiose hervatting en het bereiken van hun volledige competentie33,34,35. Tot nu toe is er echter geen 3D-systeem ontwikkeld dat geschikt is voor coc’s, geïsoleerd van grote huisdieren, waaronder varkens, is ontwikkeld.
Dit werk beschrijft twee protocollen die kunnen worden gebruikt voor de 3D-cultuur van varkens COC’s. Het eerste protocol beschrijft inkapseling bij fibrin-alginaatkralen (FAB). FAB kan worden gevormd door gelijktijdig een alginaat en fibrinoplossing te mengen, die een synchrone gelatieproces ondergaan. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving omdat beide componenten bijdragen aan matrixstijfheid. Een soortgelijke oplossing is eerder gebruikt voor de muizenzakzak follikel cultuur en rijping36. In het geval van het gepresenteerde protocol worden, om voortijdige afbraak van het alginaatfibrinnetwerk te voorkomen, op passende wijze hogere concentraties calciumchlorideoplossing gebruikt, waardoor een snel en stabiel gelatieproces wordt gewaarborgd. De dynamische mechanische omgeving creëert soortgelijke omstandigheden in de natuurlijke intra-folliculaire omgeving waarin COC’s zich bevinden en in omvang toenemen. Bovendien toont het werk representatieve resultaten van COC 3D-kweeksystemen, waarin deze worden opgeschort in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes, om microbioreactoren te vormen (Knikkers, LM). LM zijn een vorm van 3D bioreactor waarvan eerder is aangetoond dat het onder andere de groei van levende micro-organismen37, tumorsferoïden38 en embryonale stamcellen39ondersteunt. LMs zijn ook met succes gebruikt voor schapen eicelcultuur40. In de meeste experimenten met LMs werden bioreactoren bereid met polytetrafluorethyleen (PTFE) poederbed met een deeltjesgrootte van 1 μm41. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van FEP, dat qua samenstelling en eigenschappen sterk lijkt op de fluoropolymeren PTFE. Maar FEP is gemakkelijker vormbaar en zachter dan PTFE en wat vooral belangrijk is, het is zeer transparant.
Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, het behoud van hun functionele relatie tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om in vitro groei te behouden, niet alleen van de eicel, maar ook van cumuluscellen eromheen en tegelijkertijd de rijping ervan te ondersteunen, is uiterst essentieel voor de succesvolle ondersteunde voortplantingstechnologieën en voor het bevorderen van het begrip van somatische cel/eicelinteracties, vooral bij soorten die langdurige folliculaire groei ondergaan, zoals mensen of varkens. Continu verbeterde IVM-technieken worden nuttig instrument om reproductieve opties te behouden in gevallen van polycyste…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn erg dankbaar voor: dr. Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) voor technische faciliteiten in TEM; aan mevrouw Beata Snakowska (Departement Endocrinologie, Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek, Jagiellonian University) voor technische bijstand; aan de afdeling Celbiologie en Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dit werk werd ondersteund door subsidie 2018/29/N/NZ9/00983 van National Science Centre Polen.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referencias
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Biología del desarrollo. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O’Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biología. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F., Turksen, K. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. , 291-299 (2017).
