该协议允许制备谷物种子(例如,大米)的横截面,以使用扫描电子显微镜分析胚乳和淀粉颗粒形态。
淀粉颗粒(SGs)根据植物物种表现出不同的形态,特别是在 Poaceae 家族的胚乳中。胚乳表型可用于使用扫描电子显微镜(SEM)分析基于SG形态型对基因型进行分类。使用SEM可以通过切片内核(果核,aleurone层和胚乳)并暴露器官内容物来可视化SG。目前的方法要求将米粒嵌入塑料树脂中,并使用切片机切片,或嵌入截断的移液器尖端,并使用剃须刀片手工切片。前一种方法需要专门的设备,而且耗时,而后者根据水稻基因型引入了一系列新的问题。特别是白垩米品种,由于其胚乳组织的易碎性,对这种类型的切片构成了问题。这里介绍的是一种用于制备用于显微镜检查的半透明和白垩米仁切片的技术,只需要移液器尖端和手术刀刀片。在移液器吸头的范围内准备切片可防止米粒胚乳破碎(对于半透明或”玻璃体”表型)和破碎(对于白垩表型)。使用这种技术,可以观察到胚乳细胞的图案化和完整SG的结构。
淀粉颗粒(SG)根据植物物种表现出不同的形态,特别是在Poaceae家族1,2的胚乳中。胚乳表型可用于使用扫描电子显微镜分析基于SG表型对基因型进行分类。SVG可以使用扫描电子显微镜(SEM)通过切片内核并撬走胚乳细胞壁来可视化2。
该技术的目的是轻松制备仅用于快速SEM分析的横向稻仁切片。该技术的发展是由于需要快速横截面方法,即在使用最少的设备进行可视化之前立即为SEM显微镜准备样品。
该技术涉及将去壳的米粒插入移液器尖端以完全固定。这在横截面白垩米仁表型时尤其重要,这些表型易碎,在压力下容易破碎3。白垩是大米中不受欢迎的质量,因为它会影响内核的外观,并导致内核在抛光和碾磨过程中容易破裂3。白垩度表现为可以用肉眼观察到的内核横截面中的不透明区域;在微观层面上,白垩的特征是小的,松散的淀粉颗粒。白垩的原因可以是遗传4,5或环境6,7。
谷物种子横截面传统上是使用化学固定方法制备的,并在样品嵌入石蜡或其他固体基质4,8,9,10之后切片。2010年,松岛法被引入,作为避免复杂和耗时的稻仁样品制备方法4。该方法涉及将去壳的米粒插入截断的移液器尖端。尖端由块修剪器固定,并使用手持剃须刀片收获薄的局部胚乳部分。2016年开发的另一项快速技术允许对各种干燥种子进行薄整切片,包括白垩品种10。这些方法推动了这里介绍的快速技术的发展。
这种新技术适用于希望获得完整的水稻籽粒横向横截面的研究人员,以便使用SEM进行胚乳表型和淀粉形态分析。
该协议代表了松岛截断移液器吸头方法4的改编,并进行了一些值得注意的修改:(1)在该技术的任何一点都不吸收内核;(2)既不需要块修剪器,也不需要超微量切片机来准备切片。本研究考察了野生型”半透明”品种(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)和日本4的突变”白垩”品系(ssg1,不合格的淀粉粒1)。选择这两个品种进行分析,以展示加工半透明和白垩型水稻切片的技术和视觉差异。
这里介绍的技术代表了一种快速,简单和敏锐的方法,用于准备横向水稻横截面以进行桌面SEM可视化。这种切片技术可以快速观察胚乳结构,胚乳细胞形状,大小和模式,复合颗粒和淀粉形态。为了进行胚乳表型和种质筛选,获得水稻籽粒4、23、24的整个横截面至关重要。将果核完全插入移液器吸头内至关重要,以防止手术刀刀片的压力迫使胚乳破碎或破碎。如果”望远镜”组合结构正确,样品可以在15秒内准备好进行可视化(表2),使用典型实验室环境中已经掌握的材料。该技术适用于任何椭球体种子在其最宽处直径约四毫米的横截面。模型草短荞(图S2A)的种子可以类似地被分割,但不会保持在环空内。较大的种子,如小麦,容易断裂,在切片时需要小心(图S2B)。
但是,此处介绍的技术存在一些限制。使用该技术获得的切片不够薄,无法使光线通过,这禁止将该技术用于基于透射光的显微方法,如明场(米粒切片25的最大样品厚度为500μm)和透射电子显微镜(TEM)(500nm最大样品厚度26).使用移液器吸头作为切片”基质”也限制了可以使用这种技术切片的种子的大小。需要进一步的故障排除,以使该技术适用于与水稻高度不同的物种,并且”基质”的大小受到可供购买的移液器吸头尺寸的限制。
该技术提供的另一个明显优势是可以从白垩表型米粒中生产的样品的质量。值得注意的是,即使是松岛的研究也承认,使用这种特定方法很难获得白垩表型4的横截面,正如本研究中为了进行比较而复制的那样(图1S)。在他们的情况下,有必要化学固定他们的白垩米样品并将其嵌入树脂中进行切片。这项新技术与桌面SEM成像相结合,使研究人员能够轻松制备用于显微镜检查的米粒的横向切片,并且比没有固定支持时具有更高的一致性(表3)。
在表型组学和代谢组学的新时代,监测诱变系和转座子标记的文库以更好地了解种子中淀粉的功能和重要性非常重要。此外,国际水稻基因库拥有超过13万个水稻种质27.像这里介绍的那样的快速种子表型技术将加快营养质量的分类和采样28。最后,鉴于气候变化的影响日益严重,这种技术可能是有用的。谷物灌浆过程中的季节性高温胁迫已被确定为白垩度的主要原因6,但最近的研究显示,全球气温上升与水稻产量白垩度增加有关7,29。这种加速的胚乳表型可能有助于为全球气温上升的影响提供广泛的农业形象。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Systems for Research(SFR Corp.)使用其Phenom ProX Desktop SEM仪器,以及Maria Pilarinos(Systems for Research(SFR)Corp.)和Chloë van Oostende-Triplet(渥太华大学医学院细胞生物学和图像采集核心设施)提供的技术援助。资金由安大略省政府经济发展,创造就业机会和贸易部的低碳创新基金(LCIF)和蛋白质易公司提供。
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |