恶性疟原虫 通过人工膜喂养进行配子体培养和蚊子感染

Summary

对疟疾寄生虫的蚊子阶段进行详细调查对于设计有效的传播阻断策略至关重要。该协议展示了如何有效地培养传染性配子体，然后将这些配子体喂给蚊子以产生 恶性疟原虫的蚊子阶段。

Abstract

疟疾仍然是最重要的公共卫生问题之一，导致严重的发病率和死亡率。疟疾是一种蚊子传播的疾病，通过雌性 按蚊 的传染性叮咬传播。疟疾控制最终将取决于多种方法，其中包括阻断与蚊子之间、通过蚊子传播和传播的方法。为了在实验室中研究疟疾寄生虫的蚊子阶段，我们优化了培养高传染性 恶性疟原 虫配子体的方案，这是从人类宿主传播到蚊子媒介所需的寄生虫阶段。 恶性疟原虫 配子体通过五个形态学上不同的步骤成熟，大约需要1-2周。该协议中描述的配子细胞培养在15天内完成，并且从第15-18天对蚊子具有传染性。这些方案的制定是为了维持感染合格配子体的连续循环，并维持寄生虫蚊子阶段的不间断供应。在这里，我们描述了配子体培养的方法，以及如何使用玻璃膜喂食器用这些寄生虫感染蚊子。

Introduction

疟疾是由 疟原虫 寄生虫引起的，并通过雌性 按 蚊的传染性叮咬传播给脊椎动物宿主。根据2019年世界卫生组织（WHO）的报告，估计有405，000人死亡，而疟疾病例总数为2.28亿例^1。大多数与疟疾有关的死亡集中在非洲区域，特别是五岁以下儿童。虽然全球疟疾的总体发病率从2010年开始下降，但近年来下降已趋于平稳，迫切需要采取额外的控制战略来消除这种疾病。

疟疾寄生虫的循环无性血液阶段引起疾病发病机制，其中一小部分分化为雌性和雄性配子体。恶性疟原虫配子体本质上是独一无二的，因为它们需要7-10天才能通过五个形态学上不同的阶段发育。从I期到IV期的未成熟配子体被隔离在骨髓实质中，并且在外周循环中基本上不存在^{2，3，4，5。}感染成熟V期配子体的红细胞在血液中释放并自由循环，被蚊子吸收。一旦进入蚊子中肠，配子体就会被激活，通过温度的变化和暴露于中肠环境，转变为雌性和雄性配子并开始蚊子阶段的发展，其最终达到蚊子唾液腺中孢子体的感染阶段^6，7。

由于Trager和Jenson⁸描述了一种培养恶性疟原虫的标准化方法，对无性血阶段的研究有了很大的进展。然而，由于缺乏可靠的性阶段培养系统，使得研究恶性疟原虫配子体，传播生物学和蚊子阶段变得困难。近年来，已经发表了几种方法，这些方法帮助实验室建立了配子体培养物^{9，10，11，12。}本手稿描述了标准化和可靠的恶性疟原虫配子体培养方案，该协议可以代表疟疾研究界的宝贵资源。这种方法能够稳健地产生成熟和传染性的配子体，再加上标准化的蚊子喂养方案，导致高度可靠的蚊子传染性。建立这些方法是为了维持配子体和蚊子期寄生虫的不间断供应。在这份手稿中，我们描述了一个彻底的配子体培养方案（图1），使用这些膜饲养器制备玻璃膜饲养器和蚊子感染（图2），解剖中肠（图3）和蚊子的唾液腺（图4），以及中肠和唾液腺解剖后蚊子感染的定量。

Protocol

下面描述的血液收集已获得约翰霍普金斯大学机构审查委员会的批准。 恶性疟原虫 在生物安全2级（BSL2）设施的无菌条件下在新鲜红细胞中培养，并谨慎处理生物材料。在涉及血液或血液制品的每个步骤之后，每个塑料器皿或玻璃器皿在正确处理之前，都要在罩内用10%的漂白剂冲洗。 1. 试剂和制备 使用寄生虫分离物 恶性疟原虫NF54（ 见材料表</stro…

Representative Results

在这里，我们展示了使用使用上述方案生成的 恶性疟原虫 NF54配子体培养物的一系列膜进料的结果（见（图5）。配子体培养在第0天以约0.5%的混合期无性培养开始，到第4天和第5天生长至约15%的寄生虫血症高峰。如图 5A 所示，在这种高度寄生虫血症下，寄生虫受到压力，无性阶段培养崩溃。然而，这种压力同时导致配子细胞生成的诱导。早期配?…

Discussion

这里描述的方法已在约翰霍普金斯疟疾研究所成功使用超过10年15、16、17、18、19、20、21、22。使用该协议产生的配子体已被用于高通量配子细胞杀灭测定^22，蛋白质组学<sup class="…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media