Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

B&#225;rbara de la Pe&#241;a Avalos; Elo&#239;se Dray

doi:10.3791/61447

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Biología

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Published: June 26, 2020

doi:

10.3791/61447

Bárbara de la Peña Avalos², Eloïse Dray²

¹Department of Biochemistry and Structural Biology,University of Texas Health Science Center at San Antonio, ²Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Abstract

Les cellules de mammifères sont constamment exposées à des produits chimiques, des radiations et des sous-produits métaboliques naturels, qui créent des types spécifiques d’insultes à l’ADN. Les agents génotoxiques peuvent endommager l’épine dorsale de l’ADN, la briser ou modifier la nature chimique des bases individuelles. Suite à l’insulte à l’ADN, les voies de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) sont activées et les protéines impliquées dans la réparation sont recrutées. Une pléthore de facteurs sont impliqués dans la détection du type de dommages et l’activation de la réponse de réparation appropriée. L’incapacité d’activer et de recruter correctement des facteurs de DDR peut conduire à l’instabilité génomique, qui sous-tend de nombreuses pathologies humaines, y compris le cancer. Les études sur les protéines DDR peuvent fournir des informations sur la réponse aux médicaments génotoxiques et les mécanismes cellulaires de la résistance aux médicaments.

Il existe deux façons principales de visualiser les protéines in vivo : l’observationdirecte, en taguant la protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente et en la suivant par imagerie vivante, ou l’immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Bien que la visualisation des protéines étiquetées fluorescentes permette une surveillance précise au fil du temps, le marquage direct dans le terminus N ou C peut interférer avec la localisation ou la fonction des protéines. L’observation des protéines dans leur version endogène non modifiée est préférable. Lorsque les protéines de réparation d’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN, leur concentration augmente localement et elles forment des groupes, ou « foyers », qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps spécifiques.

Bien que la détection des foyers protéiques ne fournisse pas de preuve définitive de l’interaction directe, la co-localisation des protéines dans les cellules indique qu’elles se regroupent jusqu’au site des dommages et peuvent éclairer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe. Une analyse minutieuse des foyers se chevauchent dans les cellules exprimant des versions sauvages ou mutantes d’une protéine peut fournir des indices précieux sur des domaines fonctionnels importants pour la fonction de réparation de l’ADN. Enfin, la co-localisation des protéines indique des interactions directes possibles qui peuvent être vérifiées par co-immunoprécipation dans les cellules, ou retrait direct à l’aide de protéines purifiées.

Introduction

Les cellules humaines sont constamment exposées à une variété d’agents d’ADN endommageant de diverses origines. Les sources exogènes consistent principalement en l’exposition aux radiations, aux produits chimiques (y compris les agents chimiothérapeutiques et certains antibiotiques) et aux virus, tandis que les principales sources endogènes comprennent des erreurs dans la réplication de l’ADN et le stress oxydatif. Les effets directs de l’exposition génotoxique peuvent aller d’une base modifiée à une rupture potentiellement mortelle à double brin d’ADN (DSB), selon le stress et la dose d’exposition. En fin de compte, les dommages non réparés ou mal réparés à l’ADN peuvent entraîner l’accumulation de mutations, les réarrangements génomiques, l’instabilité du génome et éventuellement conduire à la carcinogenèse¹. Les cellules de mammifères ont développé des voies complexes pour reconnaître des types spécifiques de dommages à l’ADN²^,³ et les réparer en temps opportun, synchronisés avec la progression du cycle cellulaire.

Le rayonnement ionisant (IR) endommage la double hélice de l’ADN et crée des ruptures à double brin (DSB), l’une des formes les plus nocives de dommages à l’ADN. Le complexe MRN (MRE11, RAD50, NBS1) fonctionne comme un capteur d’ADN se termine et active la protéine kinase ataxie telangiectasia muté (ATM)⁴^,⁵. Suite à l’activation initiale de l’ATM par les extrémités de l’ADN, ATM déclenche une cascade d’événements DDR sur le site de la pause, initiant avec un événement clé, la phosphorylation de la variante histone H2AX⁶. La phosphorylation H2AX sur les résidus S139 l’active en γH2AX, couvrant les régions jusqu’à des mégabases autour de la lésion de l’ADN⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Cet événement augmente l’accessibilité de l’ADN, conduisant au recrutement et à l’accumulation d’autres protéines de réparation d’ADN⁷. Étant donné que γH2AX est abondamment et spécifiquement induit par les DSB environnants, il peut être facilement visualisé à l’aide d’anticorps spécifiques, et est couramment utilisé comme marqueur de substitution pour les DSB dans le domaine de la réparation de l’ADN. Une fois la rupture signalée, les cellules activent leurs voies de réparation de l’ADN et traitent les dommages causés par l’ADN. La protéine MDC1 (mediator de la protéine de point de contrôle des dommages de l’ADN 1) lie directement γH2AX¹⁰, interagit avec atm¹¹ et aussi avec NBS1¹²^,¹³. Il contribue à accroître la concentration du complexe MRN à l’ORD et à lancer une boucle de rétroaction positive aux guichets automatiques. γH2AX est rapidement enlevé une fois la rupture réparée, ce qui permet la surveillance du dégagement d’ORD. Suivie d’une microscopie, la diminution du γH2AX au fil du temps fournit une mesure indirecte des ruptures résiduelles et de l’efficacité de la réparation de l’ADN.

Les cellules eucaryotes peuvent réparer les DSB par plusieurs voies, les deux principales étant l’assemblage final non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) (Figure 1). NHEJ ligates essentiellement ADN double brin se termine sans l’utilisation de l’homologie étendue et fonctionne tout au long du cycle cellulaire¹⁴^,¹⁵. Hr devient prédominant pendant les phases S et G2, et est autrement réprimé, car il nécessite une sœur chromatid comme un modèle homologue pour la réparation¹⁴^,¹⁶. Le choix de la voie entre le NHEJ et le HR dépend non seulement de la proximité physique du chromatid sœur, mais aussi de l’extension de la résection d’extrémité de l’ADN¹⁷, qui inhibe le NHEJ.

La réparation d’ADN homologie-dépendante initie par la dégradation nucléolytique du brin de 5′ des extrémités de rupture pour produire 3′ queues d’ADN à un brin (ssDNA), un processus appelé résection de 5′-3′. Le complexe MRN initie la résection finale de l’ADN et la résection est traitée en combinaison avec BLM/EXO1 (protéine du syndrome de Bloom/exonucléase 1) ou BLM/DNA2 (réplication de l’ADN hélicase/nucléase dépendante de l’ATP)¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²². La résection finale de l’ADN est améliorée par le CtIP (protéine d’interaction CtBP) par son interaction directe avec le complexe^{MRN 23} et le recrutement de BRCA1 (protéine de susceptibilité de type 1 du cancer du sein)²⁴^,²⁵. La protéine de réplication A (RPA) se lie rapidement à l’ADN SsDN exposée et est ensuite déplacée par la protéine recombinase RAD51 pour former un filament de nucléoprotéine qui catalyse la recherche homologue et l’invasion de brin²⁶^,²⁷^,²⁸.

L’initiation de la résection est une étape critique pour le choix de la voie de réparation. Une fois la résection commencée, les extrémités d’ADN deviennent de pauvres substrats pour la liaison par l’hétérodimer Ku70/Ku80 (composant de la voie NHEJ) et les cellules sont engagées à HR¹⁷^,²⁹^,³⁰. L’hétérodimère Ku70/Ku80 se lie aux extrémités de l’ORD, recrutant des ADN-PKcs et p53 Binding Protein 1 (53BP1)²⁹^,³⁰. 53BP1 agit comme un obstacle à la résection en G1, bloquant ainsi hr tout en faisant la promotion de NHEJ³¹^,³², mais il est supprimé d’une manière BRCA1-dépendante dans la phase S, permettant par conséquent la résection de se produire³³^,³⁴. Par conséquent, 53BP1 et BRCA1 jouent un rôle opposé dans la réparation de l’ORD, avec 53BP1 étant un facilitateur NHEJ tandis que BRCA1 agit permettant des pauses pour réparer par hr.

En laboratoire, la formation d’ORD peut être induite par le rayonnement ionisant (IR). Bien que cet exemple utilise une dose élevée de 4 Gy, 1 Gy et 2 Gy également créer une quantité significative de DSBs, adapté à l’analyse de la formation de foyers par des protéines abondantes. Il est important de noter que le type et la dose de rayonnement utilisé peuvent conduire à différentes lésions dans l’ADN et dans la cellule: tandis que l’IR induit DSBs, il peut également causer des ruptures de brin unique ou la modification de la base (voir³⁵^,³⁶ pour une référence sur le transfert d’énergie linéaire irradiation (LET) et le type de dommages à l’ADN). Pour déterminer la cinétique de la formation de foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) et leur dégagement, qui indiquent la réparation des dommages et l’inversion du DDR^{activé 8}^,⁹^,³⁷^,³⁸, la formation de foyers peut être surveillée à différents points de temps après rayonnement ionisant. Le moment de l’activation et le dégagement de toutes les protéines majeures de dommages d’ADN est connu³⁹, et beaucoup sont étudiés en tant que marqueurs de substitution des événements principaux. Par exemple, pRPA, qui possède une forte affinité pour l’ADN SsDN est utilisé comme un substitut de la résection de rupture, protéines MRN (MRE11, RAD50, NBS1) et exonucleases peuvent être utilisés pour évaluer l’efficacité de la résection aussi. Bien que RAD51, BRCA1, BRCA2 (protéine de susceptibilité de type 2 du cancer du sein) et PALB2 (partenaire et localisateur de BRCA2) puissent être surveillés pour évaluer l’efficacité des RH, la présence des protéines Ku ou 53BP1, sont utilisés comme marqueurs de NHEJ (Figure 1).

Comme les protéines des machines de réparation de l’ADN se recrutent les unes les autres à la rupture et s’assemblent dans des super-complexes, l’ADN-protéine et les interactions protéines-protéines peuvent être déduites en suivant leur localisation individuelle au fil du temps et en analysant la co-localisation des protéines, telle que visualisée par des signaux qui se chevauchent dans la cellule⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Dans les lignées cellulaires, l’introduction de mutations ponctuelles ou la suppression dans des gènes spécifiques de réparation de l’ADN, soit par l’édition du génome, soit par surexpression de mutants à base de plasmide, permet d’enquêter sur des résidus spécifiques et leur rôle possible dans la reconnaissance des dommages à l’ADN (p. ex., co-localisation avec γH2AX) ou d’assemblage complexe (co-localisation avec une autre ou plusieurs protéines), ainsi que leur impact sur la réparation de l’ADN. Ici, nous utilisons l’immunofluorescence indirecte comme moyen d’étudier la formation et la résolution des DSB en suivant les foyers γH2AX au fil du temps. Nous présentons également un exemple de formation de foyers et d’analyse de co-localisation par un acteur majeur de la réparation de l’ORD : p53 Binding Protein 1 (53BP1)³². Comme mentionné précédemment, 53BP1 est considéré comme central pour le choix de la voie de réparation de l’ADN. Après l’accumulation de 53BP1 et sa co-localisation avec γH2AX fournit des informations précieuses sur la phase de cycle cellulaire, l’accumulation de dommages d’ADN, et la voie utilisée pour réparer les DSB. Le but de l’immunolocalisation indirecte est d’évaluer l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN dans les lignées cellulaires, à la suite de l’IR comme dans cette étude, ou après l’exposition à diverses contraintes dans les cellules, de croisement d’ADN au blocage de la fourche de réplication (une liste d’agents d’endommagement de l’ADN est fournie dans le tableau 1).

Figure 1 : Ruptures de ruptures à double brin d’ADN (DSB) voies de réparation.
La réparation d’ORD implique deux voies principales : la recombinaison homologue (HR, gauche) et l’assemblage non homologue (NHEJ, à droite). Après la pause, les protéines sont activées pour marquer la rupture (γH2AX), participer à la résection finale (MRN), enrober le ssDNA réséqué (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la SSDNA (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la resEJ (53BP1). D’autres protéines participent à la réparation des dommages, mais les protéines énumérées sont systématiquement suivies d’immunofluorescence indirecte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Agent d’endommagement d’ADN	Mécanisme d’action	Dose recommandée
rayons γ/rayons X	Rayonnement Formation de ruptures à double brin avec certains effets cellulaires incontrôlés	1-4 Gy
³⁶ Ions Ar	Rayonnement Formation de pauses à double brin	270 keV/μm
α-particules	Rayonnement Formation de pauses à double brin	116 keV/μm
Bleomycine	Inhibiteur de la synthèse de l’ADN	0,4 à 2 μg/mL
Camptothécine	Inhibiteur de la topoisomérase I	10-200 nM
Cisplatine	Agent alcalin (induisant des liens croisés intrastrand)	0,25 à 2 μM
Doxorubicine	Agent intercalaire Inhibiteur de la topoisomerase II	10-200 nM
Etoposide	Inhibiteur de la topoisomerase II	10 μM
Hydroxyurea	Inhibiteur de la synthèse de l’ADN (par ribonucléotide reductase)	10-200 μM
Méthane de méthyle	Agent alcalin	0,25 à 2 mM
Mitomycine C	Agent alcalin	0,25 à 2 μM
Lumière ultraviolette (UV)	Formation de dimers thymidine (générant une distorsion de la chaîne d’ADN)	50-100 mJ/cm²

Tableau 1 : Agents génotoxiques. Exemples d’agents d’ADN nuisibles, leur mécanisme d’action et les dommages induits en fonction de la concentration de travail suggérée.

Protocol

1. Culture cellulaire HeLa Prétraiter les couvercles ronds en verre de 1 M HCl à 50 °C pendant 16-18 heures. Rincer avec ddH2O et conserver dans 100% EtOH. Préparer le milieu de culture cellulaire : ajouter 10 % (v/v) FBS au milieu DMEM. Cultiver 4,0 x 104 cellules/puits dans une plaque stérile de 12 puits avec une couverture en verre rond de 18 mm à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Développer les cellules à 80% de confluence (envir…

Representative Results

Le jour 2, ou 24 h après les cellules d’ensemencement sur les couvercles, les cellules ont subi une division et sont confluentes à 80%. Des baisses ou des mutations spécifiques dans les protéines de réparation de l’ADN peuvent augmenter le temps de doublement, ou sensibiliser les cellules au traitement génotoxique, et la densité d’ensemencement ainsi que les doses de traitement devraient être ajustées en conséquence. Pour déterminer les meilleures conditions de travail, le moment de la réponse aux domma…

Discussion

L’analyse du moment et de l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN par microscopie s’est avérée essentielle pour comprendre le fonctionnement de la machinerie de réparation de l’ADN, dans les cellules normales et dans les pathologies humaines telles que le cancer.

Le développement d’anticorps spécifiques qui permettent la détection de protéines activées dans leur version phosphorylé (tels que γH2AX, pRPA, pRAD50 et autres¹⁰^,…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la San Antonio Area Foundation. Le Mays Cancer Center est soutenu par NCI cancer center support core grant P30 CA054174. Nous tenons à remercier Stephen Holloway pour son aide à l’approvisionnement des réactifs, et le laboratoire Sung pour fournir l’espace et la capacité de microscopie.

Materials

16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl₂)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.

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Citar este artículo

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).