Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

Summary

A capacidade de avaliar o engajamento de alvos por inibidores candidatos em células intactas é crucial para a descoberta de drogas. Este protocolo descreve um ensaio de mudança térmica celular de formato 384 que detecta de forma confiável o engajamento de alvos celulares de inibidores visando shp2 tipo selvagem ou suas variantes oncogênicas.

Abstract

O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2), codificado pelo proto-oncogene PTPN11, é um mediador-chave da sinalização celular orientada por tyrosina quinase receptora (RTK), promovendo a sobrevivência celular e a proliferação. Além disso, o SHP2 é recrutado por receptores de ponto de verificação imune para inibir a ativação de células B e T. A função Aberrant SHP2 tem sido implicada no desenvolvimento, progressão e metástase de muitos cânceres. De fato, inibidores de pequenas moléculas SHP2 entraram recentemente em testes clínicos para o tratamento de tumores sólidos com ativação da via Ras/Raf/ERK, incluindo tumores com algumas mutações oncogênicas ras. No entanto, a classe atual de inibidores de SHP2 não é eficaz contra as variantes oncogênicas SHP2 que ocorrem frequentemente em leucemias, e o desenvolvimento de pequenas moléculas específicas que visam o SHP2 oncogênico é o tema da pesquisa atual. Um problema comum com a maioria das campanhas de descoberta de drogas envolvendo proteínas citosósicas como o SHP2 é que os ensaios primários que impulsionam a descoberta química são frequentemente ensaios in vitro que não relatam o engajamento de alvos celulares de compostos candidatos. Para fornecer uma plataforma para medir o engajamento de alvos celulares, desenvolvemos ensaios de mudança térmica celular SHP2 do tipo selvagem e mutantes. Estes ensaios detectam de forma confiável o engajamento de alvos de inibidores de SHP2 nas células. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente deste ensaio, que fornece uma ferramenta valiosa para a avaliação e caracterização dos inibidores SHP2.

Introduction

A fosforilação da tyrosina desempenha um papel importante na transdução de sinal nas células^1,,2. Esta modificação pós-translacional é catalisada por proteínas tyrosina quinases (PTKs) e revertida por fosfattases de proteína tyrosina (PTPs). Portanto, a aberrante função PTK ou PTP leva a muitas doenças humanas herdadas ou adquiridas^3,4,,5,6. O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2) é um PTP não receptor amplamente expresso codificado pelo proto-oncogene PTPN11⁷ e é um regulador-chave de numerosos processos fisiológicos que envolvem transdução de sinal por ativação das vias de sinalização Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt, ou jak/STAT sinalizando caminhos⁸. Normalmente, a atividade SHP2 é fortemente regulada para evitar sinalizações aberrantes. Sob condições basais, o SHP2 é autoinibido pelo seu domínio SH2 n-terminal, que bloqueia o acesso ao local ativo dentro do domínio fosfatase catalítico(Figura 1A)^9,,10. Após a ativação celular, as proteínas de ligação de fosforilalatados de tyrosina recrutam SHP2, fazendo com que adote sua conformação ativa, na qual o local ativo agora está acessível aos seus substratos. Em muitos cânceres, a atividade SHP2 é elevada. Mutações de ganho de função somática (GOF) no PTPN11 foram identificadas principalmente em leucemias e impedem a vinculação do domínio N-SH2 ao domínio fosfatase, resultando em SHP2(Figura 1B)¹¹. Mutações germinas em PTPN11 são responsáveis por ~50% dos casos de síndrome de Noonan, uma desordem de desenvolvimento com risco aumentado de malignidade¹². Em tumores sólidos, onde as mutações PTPN11 são raras, maiores níveis de proteínas de ligação fosfoilada levam a uma atividade SHP2 aprimorada(Figura 1C). O SHP2 também é importante para a sinalização de ponto de verificação imune, pois receptores de ponto de verificação como BTLA ou PD-1 recrutam SHP2 para desfosforilarar moléculas-chave de sinalização, impedindo a ativação de células imunes^13,,14,,15.

Mirar PTPs com pequenas moléculas tem sido um desafio, pois o local ativo dos PTPs é altamente conservado e altamente carregado; inibidores que visam o local ativo são muitas vezes potentes, mas apresentam pouca seletividade e biodisponibilidade oral^{16,17,18,19,,20,,21,,22}. De fato, muitos inibidores SHP2 relatados sofrem de pouca seletividade e falta de eficácia nas células²³. Recentemente, foram relatados inibidores alusivos de SHP2 com boa potência e excelente seletividade (por exemplo, SHP099²⁴ e RMC-4550²⁵) e despertaram interesse renovado nos inibidores de SHP2. Compostos baseados em SHP099 e RMC-4550 estão atualmente em ensaios clínicos de fase I para tratar tumores sólidos com ativação da via tyrosina quinase receptora (RTK)^26,27. Embora inovadores, esses compostos são ineficazes contra muitos dos mutantes oncogênicos SHP2 que impulsionam a leukemogênese em um número significativo de pacientes com câncer de sangue^28,,29,30. Essa falta de potência dos compostos semelhantes ao SHP099 em relação às variantes oncogênicas SHP2 decorre de seu mecanismo alergênico único, pois inibem a atividade SHP2, vinculando e estabilizando a conformação inativa e fechada, que é interrompida em mutantes SHP2. Além disso, com base em um relatório recente^31,os mecanismos de resistência adaptativa em pacientes tratados com inibidores semelhantes ao SHP099 são bastante concebíveis. Consequentemente, o desenvolvimento de inibidores SHP2 de próxima geração que visam seu estado ativo e aberto é objeto de intensa pesquisa.

A caracterização dos novos inibidores SHP2 nas células é um aspecto essencial do processo de otimização do chumbo. Criticamente, o engajamento comprovado do inibidor em condições fisiológicas fornece um nível adicional de confiança de que os recursos para a química medicinal são eficientemente implantados em compostos com eficácia celular promissora. No passado, vários métodos para avaliar a ligação de inibidores de pequenas moléculas aos seus alvos foram desenvolvidos, principalmente para as quinases proteicas³². Para desenvolver um ensaio de engajamento de alvos celulares SHP2, utilizamos um ensaio de mudança térmica celular³³. Este ensaio, semelhante ao ensaio de mudança térmica in vitro (PTS) para proteínas^34,monitora a estabilidade térmica da proteína alvo, que é tipicamente alterada pela ligação de pequenas moléculas. O ensaio original é um ensaio de baixo rendimento que utiliza anticorpos para quantificar os níveis de proteína alvo. Alternativamente, escolhemos uma variante recentemente relatada do ensaio de mudança térmica que utiliza um ensaio de complementação de fragmento de enzima β-galactosidase (EFC)(Figura 2)³⁵. Para esses experimentos, a proteína de interesse é expressa nas células como uma proteína de fusão terminal N ou C carregando uma etiqueta ProLabel aprimorada (ePL, um fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidase). As células são então transferidas para placas compatíveis com PCR de 384 poços e incubadas com compostos de interesse. Um termociclador é utilizado para aplicar um gradiente de temperatura às células, cujas proteínas irão desnaturar e agregar à medida que a temperatura aumenta com base em sua estabilidade térmica. A capacidade de um composto candidato para ligar e estabilizar a proteína de interesse resultará em um aumento da estabilidade térmica dessa proteína. Portanto, seguindo a lise das células, as proteínas marcadas que foram estabilizadas por um composto candidato permanecerão em solução a temperaturas mais altas do que as proteínas marcadas das células incubadas com o controle do veículo. O aceitador de enzimas repórteres (EA) é capaz de complementar as proteínas solúveis marcadas por EPL, resultando em atividade detectável β-galactosidase usando um substrato de luminescência.

Recentemente desenvolvemos um robusto ensaio de mudança térmica celular para SHP2 (SHP2-WT) e uma variante oncogênica SHP2 frequente (SHP2-E76K) em um formato 384-well miniaturizado^{384-well 36}. Aqui, relatamos um protocolo detalhado deste ensaio, que detecta de forma confiável o engajamento de alvos por inibidores de SHP2 nas células e demonstra um alto grau de correlação entre potência inibidora e dados de mudança térmica celular. O fluxo de trabalho de ensaio geral é ilustrado na Figura 3. Nossa plataforma usa proteínas de fusão ePL-SHP2 marcadas em n-terminal. Para a geração dos plasmídeos de expressão correspondentes pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, consulte nossa recente^{publicação 36}. Este ensaio pode ser realizado usando um gradiente térmico para estabelecer perfis térmicos SHP2 e determinar temperaturas de fusão SHP2 na presença ou ausência de inibidor. Uma vez estabelecidos perfis térmicos, ele também pode ser realizado em condições istermais, permitindo a avaliação inibidora da dose-resposta. Ambos os tipos de experimentos são descritos abaixo.

Protocol

1. Preparação da cultura celular e reagentes Formule uma garrafa de 500 mL de mídia de crescimento com soro bovino fetal de 10%, 1x antibiótico/antimicocítico, 20 mM HEPES e 1 mM piruvato de sódio. Armazenar a 4 °C. Descongele os reagentes de mudança térmica celular (reagente EA, tampão de lise e substrato) de garrafas de caldo originais congeladas. Dispense reagentes e tampão como alíquotas de 2 mL e armazene a -20 °C.NOTA: Evite congelar/descongelar para reprodutibilidade …

Representative Results

O experimento de gradiente térmico para SHP2-WT resultou em um perfil térmico celular sigmoidal com uma transição estreita de fusão que é típica e consistente para uma proteína dobrada(Figura 4A). O SHP2 consiste em três domínios independentes: dois domínios SH2 e o domínio catalítico(Figura 1). Na conformação fechada autoinibida esses domínios se auto-associam; a transição de fusão observada no experimento do perfil térmico presumivelmente r…

Discussion

Apresentamos um ensaio de engajamento de alvo que pode confirmar a ligação direta de pequenas moléculas à fosfattase SHP2 nas células. O ensaio pode discriminar entre inibidores de baixa e alta afinidade e, principalmente, confirmar a falta de potência pelos inibidores alergênicos do tipo SHP099 para o mutante SHP2-E76K oncogênico gof. Uma força deste ensaio miniaturizado é sua capacidade de ser integrado em uma campanha de triagem inibidora SHP2. A capacidade do ensaio de confirmar a ligação intracelular ao …

Materials

384-well gradient equipped thermocycler	Eppendorf AG	X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified	Beckman Coulter, Inc.	LP-0200
6-well cell culture plates	Greiner Bio-One	657 160	Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X	Thermo Fisher Scientific	15240-062
Cell counter	Thermo Fisher Scientific	Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566-016	500 mL
Echo acoustic liquid handler	Beckman Coulter, Inc.	Echo 550
Electronic multichannel pipette	Thermo Fisher Scientific	E1 ClipTip
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140-079	500 mL
HEPES buffer	Thermo Fisher Scientific	15630-680	100 mL
InCell Pulse starter kit	Eurofins DiscoverX Corp.	94-4007	Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader	Tecan Trading AG	Spark
Single channel solution trough	Thermo Fisher Scientific	S253012005
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-010	100 mM
Thermal microplate sealer	Agilent Technologies, Inc.	PlateLoc
Transfection reagents	Polyplus Transfection	jetPRIME
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
TrypLE Express reagent	Thermo Fisher Scientific	12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates	Eppendorf AG	30132734