عزل النواة من أورام الدماغ المجمدة الطازجة لنواة واحدة RNA-seq و ATAC-seq
Summary
التغايرية داخل الورم هي سمة متأصلة في الأورام، بما في ذلك الأورام الدبقية. لقد طورنا بروتوكولا بسيطا وفعالا يستخدم مزيجا من المخازن المؤقتة والطرد المركزي المتدرجة لعزل نواة واحدة عن أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة لدراسات تسلسل نواة واحدة من الحمض النووي الريبي و ATAC.
Abstract
تظهر الأورام الدبقية المنتشرة للبالغين عدم تجانس بين الورم وداخله. حتى وقت قريب، ركزت غالبية جهود التنميط الجزيئي على نطاق واسع على النهج السائبة التي أدت إلى التصنيف الجزيئي لأورام الدماغ. على مدى السنوات الخمس الماضية، أبرزت نهج تسلسل الخلايا المفردة العديد من السمات الهامة للأورام الدبقية. وقد استخدمت غالبية هذه الدراسات عينات جديدة من ورم الدماغ لعزل الخلايا المفردة باستخدام قياس التدفق الخلوي أو طرق الفصل القائمة على الأجسام المضادة. وللمضي قدما، فإن استخدام عينات الأنسجة المجمدة الطازجة من البنوك الحيوية سيوفر مرونة أكبر لتطبيقات الخلايا الواحدة. وعلاوة على ذلك، مع تقدم حقل الخلية الواحدة، سيكون التحدي التالي هو توليد بيانات متعددة الوميست من خلية واحدة أو نفس إعداد العينة لكشف تعقيد الورم بشكل أفضل. لذلك، فإن البروتوكولات البسيطة والمرنة التي تسمح بتوليث البيانات لطرق مختلفة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) والنواة الوحيدة Assay ل Chromatin التي يمكن الوصول إليها بواسطة Transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) ستكون مهمة لهذا المجال.
وقد سهلت التطورات الأخيرة في مجال الخلية الواحدة إلى جانب الأدوات الدقيقة الفلورية التي يمكن الوصول إليها مثل منصة الجينوم 10x تطبيقات الخلايا المفردة في مختبرات البحوث. لدراسة عدم تجانس ورم الدماغ، وضعنا بروتوكولا معززا لعزل نواة واحدة من الأورام الدبقية المجمدة الطازجة. يدمج هذا البروتوكول بروتوكولات الخلية المفردة الموجودة ويجمع بين خطوة التجانس متبوعة بالتنقية والطرد المركزي المتدرجة الوسيطة المخزن المؤقت. العينات الناتجة هي تعليق نواة واحدة نقية التي يمكن استخدامها لتوليد التعبير الجيني نواة واحدة وبيانات الوصول الكروماتين من إعداد النوى نفسه.
Introduction
الأورام الدبقية المنتشرة من الدرجة الأدنى (LGG)، وهي ورم الدماغ الأساسي الأكثر شيوعا لدى البالغين، هي الأورام المتسللة التي تنشأ في كثير من الأحيان في نصف الكرة الدماغي. LGGs تظهر كل من التغايرية بين وداخل الورم، والتي ليست مدفوعة فقط من قبل السكان الورم ولكن أيضا من قبل الخلايا غير الخبيثة تشارك بشكل معقد في تطور الورم والتقدم1،2،3،4،5.
على مدى العقد الماضي، كان هناك سيل من البيانات الجينومية التي تم جمعها في مجال الأورام الدبقية. هذه البيانات تأتي أساسا من الدراسات تسلسل الورم السائبة وساهمت بشكل كبير في التوصيف الجزيئي، والتصنيف الحالي لأورام الدماغ5،6،7،8،9،10،11. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسات كشفت عن المشهد الجزيئي الواسع المرتبط بالأورام الدبقية ، لا يزال هناك نقص مخيب للآمال في التقدم فيما يتعلق بالتدخل العلاجي. واحدة من العقبات التي تحول دون مقاومة العلاج في أورام الدماغ هو عدم التجانس داخل الورم. لمعالجة هذه المسألة، وقد تم التركيز على دراسات مختلفة الجينوم، transcriptomic، proteomic، والتغايرية اللاجينية موجودة داخل ورم في مستوى خلية واحدة12،13،14،15،16،17.
على الرغم من أن هناك تقدما تكنولوجيا ملحوظا في مجال الخلية الواحدة على مدى العامين الماضيين، واحدة من العوامل الرئيسية المقيدة هو توافر العينات الطازجة اللازمة لعزل الخلايا وإجراء هذه التجارب. للتغلب على هذا القيد، كانت هناك عدة محاولات ناجحة في إجراء المقايسات، مثل snRNA-seq و snATAC-seq من الأنسجة المجمدة، وذلك باستخدام النوى بدلا من الخلايا18،19. وتعتمد غالبية هذه الأساليب إما على فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) أو استراتيجيات الترشيح. كل من خلية واحدة ونهج نواة واحدة لها نقاط قوتها وعيوبها. نهج خلية واحدة الحفاظ على النصوص الميتوكوندريا، والتي على الرغم من أنها قد تكون مفيدة، يمكن أيضا أن تقلل من تغطية النسخ بسبب وفرة عالية. نهج عزل نواة واحدة القضاء على نسبة عالية من كسر الميتوكوندريا، مما يسمح بتغطية أكثر عمقا من النصوص النووية20.
هناك العديد من المنصات المتاحة تجاريا التي تم استخدامها على مدى السنوات الأخيرة لتقصي بيانات الجينوم خلية واحدة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي-seq و ATAC-seq. واحدة من أبرز المنصات هي منصة الكروم الجينوم 10x للتعبير الجيني خلية واحدة والخلية الواحدة ATAC التنميط. كما تعمل المنصة بمساعدة غرف microfluidic، يمكن لأي حطام أو مجاميع تسد النظام مما يؤدي إلى فقدان البيانات والكواشف والعينات السريرية القيمة. لذلك ، يعتمد نجاح دراسات الخلايا المفردة إلى حد كبير على العزل الدقيق للخلايا / النوى المفردة.
البروتوكول الذي سنوضحه هنا هو مزيج معدل قليلا من بروتوكولات DroNc-seq و Omni-ATAC-seq ، ويستخدم نهجا مماثلا للدراسات الحديثة التي تستخدم snRNA-seq لفهم الاضطرابات العصبية وأنواعالخلايا العصبية في الدماغ البشري18و19و21و22و23و24. يستخدم البروتوكول مزيجا من الانزيمية / التفكك الميكانيكي للعينات المجمدة تليها الترشيح والطرد المركزي التدرج ويسمح لعزل سريع ودقيق من نواة واحدة من أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة. لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس إعداد النوى من عينات ورم الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
مجال التغاير داخل الورم هو في مرحلة مثيرة، مع المقايسات الجديدة والمنصات التي يجري تطويرها لتحدي وتوسيع المعرفة القائمة. التغاير داخل الورم هو عامل حاسم يساهم في تطور المرض ومقاومة طرائق العلاج الحالية في الأورام الدبقية28. وقد ركزت الدراسات الحديثة على أورام الدماغ على هذا ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المختبر المفتوح للخلية الواحدة (scOpenLab) في المركز الألماني للسرطان (DKFZ) على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعونة الألمانية للسرطان، ماكس إيدر برنامج منحة رقم 70111964 (S.T.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352235 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referencias
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Investigación sobre el cáncer. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).
