إن توضيح طريقة عمل المضادات الحيوية الجديدة مهمة صعبة في عملية اكتشاف الدواء. الهدف من الطريقة المذكورة هنا هو تطبيق القياسات الحرارية الحرارية باستخدام calScreener في التنميط المضاد للبكتيريا لتوفير نظرة إضافية على تفاعلات ميكروباء المخدرات.
ونظراً للتهديد العالمي المتمثل في ارتفاع مقاومة مضادات الميكروبات، هناك حاجة ماسة إلى مضادات حيوية جديدة. نحن نتحرى عن المنتجات الطبيعية من Myxobacteria كمصدر مبتكر لهذه المركبات الجديدة. اختناق واحد في العملية هو عادة توضيح أسلوب العمل الخاصة بهم. لقد أنشأنا مؤخراً قياس حرارية حرارية مجهرية متساوي الاتسام كجزء من خط أنابيب تنميط روتيني. تسمح هذه التقنية بالتحقيق في تأثير التعرض للمضادات الحيوية على الاستجابة الأيضية البكتيرية الكلية، بما في ذلك العمليات التي يتم فصلها عن تكوين الكتلة الحيوية. الأهم من ذلك، آثار بكتيريا ومبيد للجراثيم يمكن تمييزها بسهولة دون أي تدخل المستخدم أثناء القياسات. ومع ذلك، فإن القياس الدقيق متساوي الاتسام هو نهج جديد إلى حد ما، وتطبيق هذه الطريقة على الأنواع البكتيرية المختلفة يتطلب عادة ما قبل التقييم لظروف القياس المناسبة. هناك بعض ثيرمجرامات مرجعية المتاحة من بعض البكتيريا، وتسهيل كبير تفسير النتائج. وبما أن مجموعة البيانات المرجعية تنمو باطراد، فإننا نتوقع أن يكون للمنهجية تأثير متزايد في المستقبل ونتوقع أن تسمح بإجراء تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع تمكن من التمييز بين فئات المضادات الحيوية.
والهدف من هذه الطريقة هو تطبيق القياسات الحرارية الأرضية الحرارية (IMC) كمقايسة متوسطة في وضع العمل (وزارة الشؤون الداخلية) تحديد ملامح المركبات المضادة للبكتيريا الجديدة. هذه الطريقة تكشف عن البيانات المتعلقة بنشاط المركبات على الأنواع البكتيرية، ويقدم معلومات عن طبيعة البكتيريا أو بكتيريا المركب نفسه.
إن ظهور المقاومة الناشئة المضادة للميكروبات (AMR) مشكلة عالمية وتؤدي إلى علاجات أقل فعالية للعدوى الشائعة بالمضادات الحيوية المعروفة1. ومع ذلك، فإن البحث عن مركبات وأدّاءات جديدة يمكن أن تحل محل أو تعمل بالاقتران مع المضادات الحيوية المعروفة مستمر، وهذا مبني على مقاربات متنوعة. المنتجات الطبيعية هي لاعب رئيسي في حملات اكتشاف المخدرات الحالية وخاصة في اكتشاف المخدرات المضادة للعدوى2. ومع ذلك ، فإن تحديد هياكل الرصاص الجديدة لتطوير المضادات الحيوية هو عملية طويلة ومطلبة ماليا3. وبالتالي، فإن الخطوات المبكرة من الاكتشاف هي في غاية الأهمية من أجل تصفية على السقالات الواعدة بالفعل في مرحلة مبكرة. وتشمل الخطوات الأولية في اكتشاف الأدوية الطبيعية المنتج الحصول على هيكل المركب، وتحديد النشاط في المختبر جنبا إلى جنب مع وزارة الداخلية وتحديد الهدف. وينبغي أن معظم المركبات الناجحة التي تكون مؤهلة لمزيد من التطوير عرض طيف إيجابي من النشاط (أي، نشاط واسع الطيف في حالة مضادات الجراثيم) ورواية وزارة الداخلية التي يمكن من خلالها التغلب على AMR الموجودة من قبل. ثم يتم فرز السقالات الواعدة عادة في المقايسات الثانوية، والتي تشمل في التوافر البيولوجي الجسماني، والسمية، والتمثيل الغذائي4. وإلى جانب المخاوف المالية، المنتج الطبيعي اكتشاف المخدرات يواجه المزيد من التحديات المتعلقة بالتكاليف والصعوبات التقنية المتعلقة العزلة المركبة وتنقيتها، والتي، بدورها، يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على كميات متعددة مليغرام أو حتى غرام في المراحل المبكرة من عملية الاكتشاف5،6. لذلك، من الأهمية القصوى في بحوث المنتجات الطبيعية أن تكون قادرة على إجراء أحدث الفحوصات الأولية مع الحد الأدنى من الكميات المركبة من أجل اتخاذ قرار مستنير بشأن المزيد من الاستثمارات لجعل منتج طبيعي جديد في متناول التنمية قبل السريرية. مع استخدام IMC لتحديد مضادة للبكتيريا ، يتم تقليل كمية المركب المطلوبة بشكل كبير بالمقارنة مع الطرق القياسية. كما توفر هذه التقنية معلومات أكثر تعمقاً بشأن تفاعل الأدوية الجديدة مع المجتمع الميكروبي7.
12- إن اللجنة البحرية الدولية هي طريقة راسخة لقياس الطاقة الكلية نتيجة لجميع العمليات البيولوجية والفيزيائية والكيميائية الحيوية والتفاعلات في النظام البيولوجي. البكتيرية الطاقة الإفراج يتناسب مع مجموع ردود الفعل الأيضية8. داخل نظام مغلق، مثل مقياس الحرارية الدقيقة المستخدمة، يمكن قياس مستويات الحرارة في نطاق microwatt لدراسة الحركية الأيضية للبكتيريا9،10،11،12. وترتبط الحرارة (الطاقة) التي يتم الإفراج عنها من قبل البكتيريا إلى الوظائف الخلوية التي تكمن وراء عملية التمثيل الغذائي الخاصة بهم والتي ليست بالضرورة متناسبة مع الكتلة الحيوية الخلوية.
في البداية، كان تطبيق قياس السعرات الحرارية الأيزوحرارية للمقايسات الميكروبيولوجية محدوداً بسبب انخفاض الإنتاجية وأحجام الاختبار العالية. ومع ذلك ، فإن المقياس الدقيق المستخدم فريد من نوعه لأنه يجمع بين مزايا قياس السعرات الحرارية isothermal مع زيادة الإنتاجية ومتطلبات المركبات الأقل ، مما يجعله أداة قيمة لتطبيقات اكتشاف الأدوية10. وعلاوة على ذلك، يوفر الجهاز مزايا إضافية على الطرق البديلة لقياس حركية النمو البكتيرية، مثل طريقة التعكر القياسية، والتي تقوم على قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD<600). ويستند قياس OD600 على افتراض أن زيادة الكثافة البصرية يساوي النمو الميكروبي، وبالتالي إهمال وجود خلايا غير قابلة للحياة. وقد انتقد هذا الأسلوب أيضا لأنه يستبعد متغيرات مستعمرة صغيرة والخلاياالمستمرة 11. في المقابل، يسمح IMC بالمراقبة في الوقت الحقيقي لأي نوع من الخلايا القابلة للحياة. إذا كانت الخلايا نائمة، فإنها لا تزال تظهر النشاط الأيضي، وبالتالي يمكن الكشف عنها من قبل IMC، في حين أن مثل هذه الظواهر لا يمكن الكشف عنها من قبل طريقة التعكر القياسية11. وتشمل المزايا الأخرى لـ IMC وقت اختبار الحساسية المضادة للميكروبات أقصر ، وقياس تفاعلات المخدرات في مجتمع معقد وطرق التحليل القياسية دون تدمير العينة7.
وقد تم تنفيذ تكنولوجيا IMC في مجموعة واسعة من الدراسات، بدءا من علم الأحياء الدقيقة إلى توليد الحرارة وعلم الأحياء السرطان13،14،15،16،17. وتشمل التطبيقات الميكروبية تحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MIC) من المركبات ضد السلالات البكتيرية المختلفة. وقد أجريت عدة دراسات وقد تم التوصل إلى أن بيانات هيئة التصنيع العسكري من قياس السعرات الحرارية isotherry لغالبية الأنواع البكتيرية يمكن الحصول عليها بشكل أسرع والنتائج مماثلة لأساليب أخرى (قياسية) لتحديد MIC12،18،19. وتشمل تطبيقات أخرى من IMC مراقبة التفاعل بين المخدرات والجمع بين العلاجات الدوائية مع المجتمعات البكتيرية المعقدة مثل الأغشية الحيوية11. وأظهرت دراسة تركز على التنميط وزارة الشؤون المالية أن microcalorimeter يمكن الكشف عن الفرق في الجيل الأول والثاني من السيفالوسبورين، في حين أن المضادات الحيوية المختلفة مع وزارة الداخلية نفس المعرض منحنى تدفق الحرارة مماثلة مقارنة مع بعضها البعض18.
هنا، نحن وصف استخدام IMC لملامح وزارة الشؤون العامة للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام أداة القياس الدقيق isothermal الجديدة. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد تركيزات المضادات الحيوية الفعالة ووصف خصائص المضادات الحيوية من حيث آليات المبيد للجراثيم أو البكتيريا. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع في تحديد ملامح وزارة الشؤون الداخلية للمركبات وقد تحل محل الطرق الميكروبيولوجية المعيارية أو تكملها على الأقل. وستشمل الدراسات المستقبلية تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع من شأنها أن تمكن من التفريق بين فئات المضادات الحيوية على أساس الآليات المستهدفة.
يقيس القياس الدقيق للمقاييس الحرارية الطاقة المنبعثة من عينة على مر الزمن، وهذا الإطلاق للطاقة هو نتيجة لجميع العمليات الكيميائية البيولوجية والفيزيائية و(البيولوجية). يمكن استغلال تدفق الحرارة المقاس لتقييم أو تحديد الآثار المضادة للبكتيريا للمواد لأنها تمكن من الرصد المستمر في الوقت الحقيقي للنشاط الأيضي.
من أجل الحصول على بيانات موثوقة للتحليل، يجب تحديد وحدات تشكيل المستعمرة الصحيحة (CFU) بشكل فردي لكل نوع أو سلالة مستخدمة. في حالة أن عدد CFU منخفض جداً، وهذا يؤدي إلى مرحلة تأخر طويلة حيث يستغرق النظام وقتاً أطول للوصول إلى كمية حرجة من الكتلة الحيوية التي تنتج ما يكفي من الحرارة ليتم الكشف عنها. في حالة أن العد CFU عالية جداً فإن مرحلة التأخر تكون قصيرة جداً، وكمية الحرارة المنتجة يمكن أن يسبب نقل الحرارة إلى خلايا الاستشعار المجاورة (المرجعية والآبار التجريبية) وتسبب تشوهات في ثيرمجرامس. كما ستؤدي أعداد كبيرة من الـ CFU إلى استنفاد أسرع للأكسجين والتحول إلى الظروف اللاهوائية. كما يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه خلال الدقائق الثلاثين الأولى من التجربة، عندما يكون النظام اِهزَاً، لا يمكن جمع البيانات ويتأخر التسجيل الفعلي للآثار. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تحديد CFU غير صحيحة إلى تحديد MIC زائف ، مما يؤثر في نهاية المطاف على التجربة والتغييراتالملاحظة 25. وثمة نقطة أخرى هامة هي التحديد الصحيح لخط الأساس. عادة، يتم تحديد إشارة خط الأساس خلال مرحلة التأخر عندما تكون إشارة تدفق الحرارة صفرًا، ومن الناحية المثالية، يكون النطاق الزمني لتعريف خط الأساس >30 دقيقة. ومع ذلك، هذا ليس ممكنا دائماً لأن الوقت الذي تتطلبه البكتيريا للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية يختلف بين السلالات والأنواع. تتطلب بعض الأنواع أو السلالات أكثر من 30 دقيقة للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية في حين أن سلالات أو أنواع أخرى تصل إليه في غضون الدقائق الثلاثين الأولى. في هذه الحالة، من الممكن تحديد إشارة خط الأساس في نهاية التجربة عندما تكون جميع إشارات الحرارة قد انخفضت مرة أخرى إلى الصفر وتظل مستقرة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام خطوط الأساس من تجارب أخرى مع نفس السلالة البكتيرية، والتي لا ينصح بها.
ويتيح النظام بعض المرونة من حيث التصميم والتحسين للتجارب واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وحدات التخزين المستخدمة هي في نطاق 100-300 ميكرولتر عند استخدام إدراج البلاستيك و 100-600 μL عند استخدام أكواب التيتانيوم دون إدراج البلاستيك. حجم العمل الموصى به من قبل الشركة المصنعة هو 120 μL. 10- إن استخدام أحجام مختلفة في إعداد سلسلة تجريبية جديدة، وفي الوقت الذي يجد فيه الظروف المثلى للقياسات، له تأثير رئيسي على المعلمات. باستخدام وحدات تخزين أقل، يمكن تقليل كمية مركب الاختبار المطلوب، وهو أمر مهم بشكل خاص للمركبات، التي لا تتوفر إلا بكميات صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤثر حجم استخدام مباشرة على توافر الأكسجين أثناء القياس مع كميات أقل زيادة كمية الأكسجين المتاحة اللازمة لنمو البكتيريا. إن استنفاد الأكسجين هو أحد العوامل الرئيسية التي تسهم في الحد الأقصى للتجربة. الأهم من ذلك ، فمن الممكن استخدام وسائل الإعلام الصلبة ، وليس فقط وسائل الإعلام السائلة. وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة للكائنات الدقيقة بطيئة النمو حيث أن النمو على الواجهة بين مرحلة الصلب والغاز يتيح الوصول إلى الأكسجين بشكل أفضل9.
IMC هو أداة تحليلية مفيدة لاكتشاف العمليات غير المعروفة مع تطبيقات في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا. الطريقة يقيس تبادل الحرارة داخل نظام مغلق وتحليل تبادل الحرارة المسجلة يوفر معلومات إضافية لا يمكن الحصول عليها دائما مع الأساليب القياسية. في أبحاث الميكروبيولوجيا والمضادات الحيوية ، واحدة من أكبر مزايا IMC هي قدرتها على التمييز بين الخلايا الحية والأموات والهادّدة أو الخاملة ، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق التعكر القياسية11. وبالإضافة إلى ذلك، IMC حساس للغاية ويمكن الكشف عن انبعاث الحرارة من عدد قليل من 104-105 الخلايا9. ميزة أخرى هي أن الإعداد التجريبي سريع وسهل ، ويسمح بالتتبع المستمر في الوقت الحقيقي مع الحد الأدنى إلى أي تدخل المستخدم. وعلاوة على ذلك، فإن اللجنة الطبية المشتركة غير مدمرة، مما يتيح إجراء مزيد من التحليل للعينات. يسمح تحليل البيانات بفصل تكوين الكتلة الحيوية حتى وقت متأخر من الطور الأسي أو المبكر والنشاط الأيضي في المرحلة الثابتة.
إلى جانب ميزات التطبيق الجديدة والمثيرة المذكورة أعلاه ، هناك أيضًا عيوب في هذا الأسلوب. والقيود الرئيسية هي أن أجهزة اللجنة تقيس الحرارة الكلية المنتجة والمطلقة داخل نظام محدد، والتي تشمل أيضا إشارات غير محددة. وهذا يسلط الضوء على أهمية التخطيط التجريبي مع الضوابط المناسبة لتكون قادرة على تقييم التغيرات إشارة الحرارة التي يتم قياسها عن طريق تسجيل تدفق الحرارة9،20.
في أيدينا، IMC هو أداة هامة لدراسة الآثار المضادة للبكتيريا من المنتجات الطبيعية الجديدة وتحديد نطاقات التركيز الفعالة. وبصرف النظر عن التمييز بين الآثار الجرثومية والمبيد للجراثيم، يمكن استخدامه في المستقبل كجزء من دراسات تحديد الهدف وتحديد وزارة الشؤون العامة. ويمكن القيام بذلك من خلال مقارنة ثيرموجرامات من مختلف فئات المضادات الحيوية إلى ثيرمجرامات المركبات النشطة الجديدة كما هو معروض هنا. ومع ذلك، لا يزال يتعين التحقق مما إذا كانت بعض البارامترات القابلة للقياس الكمي التي يمكن استخلاصها من البيانات المقاسة كافية لمثل هذه المقارنات أو إذا كان من الضروري العمل على خوارزميات تعطي بصمات الأصابع استناداً إلى حرارية كاملة. تطبيق آخر ممكن في مجال البحوث المضادات الحيوية هو مقارنة النمط البري إلى الحيوانات المستنسخة المقاومة، إلى جانب تسلسل الجينوم كله، والتي يمكن أن تساعد في توضيح طريقة المقاومة (MoR) من مضادات الجراثيم الجديدة. وبسبب الطبيعة الساكنة للطريقة، فإن التحقيق في فعالية العوامل الجديدة في تكوين البيو فيلم أو على الأغشية الحيوية المنشأة بالفعل يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للعملية البيولوجية وتأثير عوامل مختارة على الميكروبات في مراحل مختلفة من السكون. IMC سجلات الطاقة الإجمالية التي أطلقت في شكل الحرارة مما يجعلها وسيلة مناسبة للتحقيق أيضا دون مثبطة الآثار من المواد الفعالة التي قد تكون مقترنة transcriptomics. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة في البيئات السريرية للكشف عن تلوث العينات أو لتحديد مضادات الحيوية مما يساعد على اتخاذ قرار سريع بشأن العلاج المحدد للمرضى11.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفان أن يشكرا فريق سيمسيل على المناقشات المثمرة ونود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الكبير الذي تقدمه كل من جوانا أوليينيك وفيلهلم بولاندر. ونود أيضا أن نشكر دانيال Kohnhäuser لتوفير المنتج الطبيعي وستيفاني شميدت للدعم الفني ماهرا.
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |