Perfil celular de alto rendimiento de compuestos de degradación de proteínas específicas utilizando líneas celulares HiBiT CRISPR

Summary

Este protocolo describe la detección luminiscente cuantitativa de la cinética de degradación de proteínas en células vivas que se han diseñado utilizando CRISPR / Cas9 para expresar la etiqueta de detección de proteínas endógenas libres de anticuerpos fusionada a una proteína diana. Se incluyen instrucciones detalladas para calcular y obtener parámetros cuantitativos de degradación, tasa, Dmax, DC 50 y Dmax₅₀.

Abstract

Los compuestos de degradación de proteínas dirigidas, incluidos los pegamentos moleculares o las quimeras dirigidas a la proteólisis, son una nueva modalidad terapéutica emocionante en el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas. Esta clase de compuestos induce la degradación de proteínas al acercar la proteína diana y las proteínas de la maquinaria de la ligasa E3 necesarias para ubiquitinar y, en última instancia, degradar la proteína diana a través de la vía ubiquitina-proteasómica (UPP). Sin embargo, el perfil de la degradación de proteínas diana de manera de alto rendimiento sigue siendo muy difícil dada la complejidad de las vías celulares necesarias para lograr la degradación. Aquí presentamos un protocolo y estrategia de cribado basado en el uso del marcaje endógeno CRISPR/Cas9 de proteínas diana con el tag HiBiT de 11 aminoácidos que complementa con alta afinidad a la proteína LgBiT, para producir una proteína luminiscente. Estas líneas celulares dirigidas a CRISPR con etiquetas endógenas se pueden usar para medir la degradación inducida por compuestos en los modos líticos de células vivas cinéticas en tiempo real o de punto final mediante el monitoreo de la señal luminiscente utilizando un lector basado en placas luminiscentes. Aquí describimos los protocolos de cribado recomendados para los diferentes formatos, y también describimos el cálculo de los parámetros clave de degradación de la tasa, Dmax, DC 50, Dmax₅₀, así como la multiplexación con ensayos de viabilidad celular. Estos enfoques permiten el descubrimiento rápido y la clasificación de compuestos en etapa temprana mientras se mantiene la expresión endógena y la regulación de las proteínas diana en fondos celulares relevantes, lo que permite una optimización eficiente de los compuestos terapéuticos principales.

Introduction

La degradación de proteínas dirigidas se ha convertido en una de las áreas de más rápido crecimiento en el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas, reforzada en gran medida por el éxito terapéutico de los compuestos de pegamento molecular inmunomoduladores (por ejemplo, IMiD) para el tratamiento del cáncer, y los prometedores datos de ensayos clínicos tempranos de proteólisis dirigidos a compuestos quimeras 1,2,3,4,5,6,7,8^{, 9,10,11,12}. Los compuestos de degradación de proteínas dirigidas funcionan acercando una proteína diana con proteínas de maquinaria de ligasa E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Este reclutamiento inducido por compuestos de la proteína diana a la ligasa E3 conduce a la ubiquitinación y degradación de la proteína diana a través de la vía proteasómica de ubiquitina (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Históricamente, los programas de detección de descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas se han basado en ensayos bioquímicos iniciales para evaluar la actividad y clasificar los compuestos de orden. Esto, sin embargo, ha presentado un desafío significativo para los degradadores de proteínas objetivo cuya actividad final, la degradación a través del proteasoma, depende de una cascada de eventos celulares 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17^{, 18}. Las múltiples vías y la complejidad de los complejos proteicos necesarios para el éxito de la degradación del objetivo requieren enfoques de ensayo celular para la detección temprana y el triaje de los compuestos iniciales. Actualmente, la disponibilidad de tecnologías para monitorear la degradación de proteínas diana de manera de alto rendimiento en el contexto del entorno celular es muy deficiente¹⁴. Aquí presentaremos protocolos para la evaluación de la actividad de degradación lítica cinética de células vivas o endpoints en tiempo real utilizando líneas celulares objetivo HiBiT marcadas endógenamente con CRISPR / Cas9 18,19,20 para monitorear la pérdida de la proteína diana a través de la medición luminiscente después del tratamiento con compuestos degradadores^10,11,18,19.

Para lograr una degradación exitosa de los objetivos terapéuticos y expandir el proteoma farmacológico, han surgido numerosos enfoques y tipos de degradadores que pueden dirigirse a una amplia gama de proteínas para su destrucción, incluidas las localizadas en o en la membrana plasmática, los lisosomas, las membranas mitocondriales, el citoplasma y el núcleo^21-57. Las dos clases principales de compuestos más ampliamente estudiadas son las pegamentos moleculares y las proteínas dirigidas a cimeras 2,4,5,6,7,12,26. Las pegamas moleculares son monovalentes, por lo que suelen ser más pequeñas en tamaño, y facilitan una nueva interacción proteína:proteína con una proteína diana al unirse a un componente de la ligasa E3 ^2,12,26. Son más comúnmente degradadores que se unen^{al componente} ligasa Cereblon (CRBN) E3 2,12,26,55,56,57. Recientemente, aunque nuevos y emocionantes ejemplos que utilizan otra maquinaria de ligasa E3 como DCAF15^58,59,60 y el reclutamiento de CDK / ciclina a DDB1⁴⁵ muestran el potencial de expansión de esta clase de compuestos. En contraste, los PROTAC son moléculas bivalentes más grandes, que consisten en un ligando de unión al objetivo, con mayor frecuencia un inhibidor, unido a través de un enlazador químico a un mango de ligasa E3 1,3,4,5,7,13. Como tales, estos compuestos son capaces de unirse directamente tanto a la ligasa E3 como a la proteína diana 1,3,4,5,7,13. Se ha demostrado que numerosas proteínas se degradan a través de estas moléculas bivalentes, y los mangos de ligasa E3 más utilizados reclutan CRBN o Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Sin embargo, el número de mangos disponibles para el reclutamiento de ligasas E3 en quimeras dirigidas al diseño de proteólisis está creciendo rápidamente, ampliando las capacidades de esta clase de compuestos con el potencial de degradar diversas clases diana, así como mejorar la especificidad del tipo celular o tisular 24,48,61,62 . Combinado con el requisito mínimo de involucrar una proteína objetivo, incluso con afinidad marginal, los compuestos de degradación son prometedores para expandir el proteoma farmacológico.

La caracterización de la dinámica celular de la pérdida de proteínas, así como la posible recuperación de proteínas después del tratamiento, es fundamental para comprender la función y eficacia del compuesto de degradación. Si bien es posible estudiar los cambios endógenos en el nivel de proteínas en sistemas celulares relevantes con ensayos de anticuerpos Western blot o espectrometría de masas, estos enfoques son difíciles de adaptar a los formatos de detección de alto rendimiento, tienen una capacidad de cuantificación limitada o la capacidad de medir cambios cinéticos en muchos puntos temporales¹⁴. Para abordar estos desafíos, hemos desarrollado un sistema luminiscente celular basado en placas para monitorear los cambios en los niveles de proteínas endógenas, que utiliza la inserción genómica a través de CRISPR / Cas9 de la etiqueta de 11 aminoácidos, HiBiT, a los loci de cualquier objetivo clave de degradación^18,19,20. Este péptido se complementa con alta afinidad a su compañero de unión, LgBiT, para producir luminiscencia brillante en presencia de su sustrato 18,19,20,63, haciendo así que estas proteínas endógenas marcadas sean luminiscentes en células o lisados 18,19,20,63 . Las unidades de luz relativa (RLU) medidas con un instrumento luminómetro son directamente proporcionales a los niveles de proteína diana marcados 18,19,20,63. Con el desarrollo de sustratos estabilizados de luciferasa, las mediciones del nivel de proteína cinética en tiempo real durante marcos de tiempo de 24-48 h son posibles 18,53,64. Esto permite la determinación de un perfil de degradación completo para cualquier objetivo dado a cualquier concentración de compuesto dada, incluido el análisis cuantitativo de la tasa de degradación inicial, el máximo de degradación (Dmax) y la recuperación después del tratamiento con compuestos^18,53. Sin embargo, si se examinan grandes bibliotecas de compuestos de degradación, el análisis de punto final también se puede realizar fácilmente en formato de 384 pocillos a varias concentraciones de fármaco y tiempos designados.

Los protocolos presentados en este manuscrito representan estrategias de detección celular para compuestos de degradación de proteínas específicos, aplicables a todos los tipos de degradadores. El uso de líneas celulares HiBiT CRISPR junto con estos protocolos, sin embargo, no se limitan a la degradación de proteínas, sino que son herramientas generales para monitorear cualquier nivel de proteína diana endógena que podría ser modulada después del tratamiento para estudiar el impacto de compuestos o incluso mecanismos de resistencia 20,65,66. Un requisito previo para estos métodos de detección basados en luminiscentes es una línea celular objetivo HiBiT marcada endógenamente con CRISPR, que es crítica ya que permite la detección luminiscente sensible, al tiempo que mantiene la expresión del objetivo endógeno y la regulación del promotor nativo^18,19,20. Se han logrado avances significativos en la utilización de CRISRP/Cas9 para la inserción de etiquetas genómicas, particularmente en escalabilidad 20 y con la alta sensibilidad de detección, en varios formatos, incluidos grupos CRISPR o clones con inserciones alélicas heterocigotas u homocigotas^18,19,20. Es posible el uso de la expresión exógena de HiBiT u otras fusiones reporteras en células en lugar del marcado endógeno, pero se debe tener precaución significativa utilizando sistemas con sobreexpresión de proteínas^14,18. Estos pueden conducir a artefactos en la comprensión de la verdadera potencia del compuesto y la dinámica de recuperación de proteínas^14,18, incluidos los posibles bucles de retroalimentación transcripcional activados después de la degradación del objetivo. Además, los compuestos en etapa temprana con baja potencia podrían pasarse por alto y presentarse como falsos negativos en la detección. Como la pérdida de proteínas podría resultar de la toxicidad inducida por compuestos y la muerte celular, los protocolos descritos aquí contienen ensayos luminiscentes o fluorescentes de viabilidad celular altamente recomendados pero opcionales emparejados con el protocolo de degradación. Hay dos secciones principales en el protocolo, el punto final lítico y la detección cinética de células vivas. Dentro de cada una de esas secciones, se incluyen opciones para mediciones de viabilidad celular multiplexada en formatos de punto final o cinéticos. El monitoreo de los cambios de la proteína endógena marcada requiere complementación con LgBiT en las células. Por lo tanto, la sección de detección cinética hace referencia a protocolos importantes para la introducción de esto, que se puede lograr a través de la expresión transitoria o estable y es esencial para realizar las mediciones luminiscentes de células vivas. Todos los enfoques presentados aquí permiten un orden rápido de clasificación y una evaluación de la actividad de los compuestos, lo que permite los esfuerzos de selección de compuestos en etapa temprana y una identificación más rápida de los degradadores de plomo.

Este protocolo está diseñado para el estudio de compuestos de degradación en conjunto con una línea celular HiBiT CRISPR. Los protocolos para la generación de inserciones HiBiT CRISPR para numerosos objetivos se han descrito en varias publicaciones recientes^18,19,20.

Protocol

1. Estudios de degradación de punto final con proteínas diana HiBiT CRISPR en formato lítico con análisis de fluorescencia de viabilidad celular opcional Preparación y recubrimiento de la línea celular adherente o en suspensión de mamíferosAjustar la densidad celular a 2,22 x 105/ml mediante dilución en medios celulares apropiados utilizados para el paso y el crecimiento celular. Dispensar las células en placas con un mínimo de 3 pocillos por condición experimental y de control. Dispensar 90 μL (20.000 células) por pocillo de suspensión celular en placas blancas de 96 pocillos. Para el formato de 384 pocillos, dispensar 36 μL (8.000 células) por pocillo de suspensión celular en placas blancas de 384 pocillos. Preparación y adición de compuestosPrepare placas de compuestos de prueba PROTAC o degradadores diluidas en serie a una concentración final de 1,000x en 100% DMSO. Luego diluirlo a una concentración final 10x en el medio de cultivo celular. Agregue un volumen igual de DMSO al medio, para usarlo como un control DMSO sin compuesto. Para el formato de 96 pocillos, agregue 10 μL de compuesto 10x y soluciones de control a 90 μL de células. Para un formato de 384 pocillos, agregue 4 μL de compuesto 10x y soluciones de control a 36 μL de células. Incubar las placas en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante el tiempo deseado o en condiciones óptimas para su crecimiento.NOTA: Como se trata de un ensayo de punto final, la prueba de múltiples puntos de tiempo requerirá la preparación de placas de degradación separadas para cada punto de tiempo, como se describe en el paso 1.1.2 anterior. Los tiempos de incubación para detectar la degradación mediada por compuestos son muy variables y también es probable que dependan de la concentración del compuesto. Los puntos de tiempo iniciales sugeridos serían 6 h y 24 h. Si se mide la detección luminiscente del punto final sin la medición opcional de la viabilidad celular, vaya directamente al paso 1.3 a continuación. Si realiza la multiplexación con medición de viabilidad celular, continúe con la siguiente sección 1.4 a continuación. Medición lítica de célulasInmediatamente antes de las mediciones líticas de HiBiT, prepare 2 veces el reactivo de detección lítica agregando 20 μL de sustrato lítico y 10 μL de proteína LgBiT por cada 1 ml de tampón lítico. Prepare suficiente reactivo de detección 2x para el número de pozos a analizar, incluido el volumen adicional para tener en cuenta el error de pipeteo (es decir, número de pozos + 10%). Agregue un reactivo de detección lítica preparado a las células. Para el formato de 96 pocillos, agregue 100 μL de 2x reactivo de detección lítica a cada pocillo que contenga 100 μL de células. Para el formato de 384 pocillos, agregue 40 μL de 2x reactivo de detección lítica a cada pocillo que contenga 40 μL de células. Mezcle la placa en un mezclador de vórtice de microplacas durante 10-20 minutos a 350 rpm. Mida la luminiscencia en un luminómetro capaz de leer la luminiscencia en una placa de 96 o 384 pocillos. Multiplexación opcional de viabilidad celularNOTA: Este paso se realiza utilizando un kit de CellTiter-Fluor (CTF) disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).30-40 minutos antes de la medición del punto final deseado, prepare una solución de reactivo de detección de viabilidad celular 6x agregando 10 μL del sustrato a 2 ml del tampón del ensayo. Prepare suficiente reactivo 6x para cada pozo a analizar, incluido el volumen adicional para el error de pipeteo (es decir, número de pocillos + 10%). Agregue el reactivo preparado a los pocillos. Para el formato de 96 pocillos, agregue 20 μL de reactivo 6x a cada pocillo que ya contenga un volumen de 100 μL. Para el formato de 384 pocillos, agregue 8 μL de reactivo 6x a cada pocillo que contenga 40 μL de células. Mezclar brevemente en un mezclador de vórtice de microplacas, luego incubar el plato durante 30 minutos en una incubadora de 37 °C. En el punto final deseado de medición (es decir, 6 o 24 h después del tratamiento, paso 1.2.3), mida la fluorescencia en un instrumento capaz de leer fluorescencia (380-400nmEx/505nmEm) en formato de 96 o 384 pocillos. Preparar 2 veces el reactivo de detección lítica añadiendo 20 μL de sustrato lítico y 10 μL de proteína LgBiT por 1 ml de tampón lítico. Prepare suficiente reactivo de detección 2x para el número de pozos a analizar, incluido el volumen adicional para tener en cuenta el error de pipeteo (por ejemplo, número de pozos + 10%). Agregue el reactivo de detección lítica preparado a los pocillos. Para el formato de 96 pocillos, agregue 120 μL de 2x reactivo de detección lítica a cada pocillo que ya contenga un volumen de 120 μL. Para el formato de 384 pocillos, agregue 48 μL de reactivo de detección lítica 2x a cada pocillo que ya contenga un volumen de 48 μL. Mezcle la placa en un mezclador de vórtice de microplacas durante 10-20 minutos. Mida la luminiscencia en un luminómetro capaz de leer la luminiscencia en placas de 96 o 384 pocillos. Cuantificación de la degradación y viabilidad celularPromedie las unidades de luz relativa (RLU) del control DMSO en el punto de tiempo medido. Utilice este valor como el nivel de proteína de referencia del objetivo para calcular la degradación fraccionada normalizando todos los demás tratamientos probados en este mismo punto de tiempo a este valor. Por ejemplo, si la RLU promedio para los pocillos de control DMSO a las 6 h fue de 10,000, y la RLU para un tratamiento compuesto dado a las 6 h fue de 5,000, la degradación fraccional se calcularía como 5,000 ÷ 10,000 = 0.5 (Ecuación 1).Ecuación 1: Determine el porcentaje de degradación de la RLU fraccional:Ecuación 2: Trazar RLU fraccional o % de degradación en puntos de tiempo específicos para clasificar la actividad de los compuestos. Opcionalmente, analice los datos relativos de la unidad de fluoresecencia (RFU) para la medición del ensayo de viabilidad celular comparando los valores de todos los tratamientos con el control DMSO. Si se observa una disminución significativa en la RFU para cualquier tratamiento en relación con el control de DMSO, los datos de degradación se pueden normalizar adicionalmente a los datos del ensayo de viabilidad celular para determinar los cambios en el nivel de proteína en relación con las pérdidas en la viabilidad celular. 2. Degradación cinética en tiempo real de las proteínas diana HiBiT CRISPR y ensayo opcional de luminiscencia de viabilidad celular NOTA: La capacidad de realizar cribado cinético y degradación requiere la coexpresión de la proteína LgBiT en la célula, que se ha descrito previamente18,19,63. Esto se puede lograr mediante la transfección transitoria de un vector LgBiT, el uso de BacMam LgBiT o la inserción de HiBiT CRISPR en una línea celular estable de LgBiT. Recubrimiento de líneas celulares adherentes.Retire el medio del matraz celular por aspiración, lave las células con DPBS, disocie las células con tripsina-EDTA al 0,05% y permita que las células se disocien del fondo del matraz. Para líneas celulares de suspensión, continúe con la sección 2.2. Neutralizar la tripsina utilizando un medio de cultivo celular que contenga suero, mezclar para recolectar y resuspender las células y transferir la suspensión celular a un tubo cónico. Girar las celdas a 125 x g durante 5 min. Desechar el medio de cultivo celular y resuspenderlo en un volumen igual de medio de cultivo celular fresco. Células en placa en placas de ensayo con un mínimo de pocillos triplicados por condición experimental y de control. Para el recuento de formatos de 96 pocillos para estimar la densidad celular, ajuste la densidad a 2 x 105 células/ml en medio de ensayo y dispensar 100 μL (20.000 células) por pocillo en una placa de 96 pocillos. Para el recuento de formatos de 384 pocillos para estimar la densidad celular, ajuste la densidad a 4,44 x 105 células/ml en el medio de ensayo y dispense 18 μL (8.000 células) por pocillo. Incubar las placas a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche o en condiciones óptimas para su crecimiento. Recubrimiento de células de suspensiónAjustar la densidad celular a 2,22 x 105 células/ml en medio independiente del CO2 suplementado con 10% de FBS y 1x Endurazina (dilución 1:100 del reactivo madre). Placas de células en placas de ensayo con un mínimo de 3 pocillos por condición experimental y de control. Para el formato de 96 pocillos, dispensar 90 μL (20.000 células) por pocillo. Para el formato de 384 pocillos, dispense 36 μL (8.000 células) por pocillo.NOTA: Para líneas celulares de suspensión que tienen baja luminiscencia señal a fondo (S:B), por ejemplo, cuando se trabaja con grupos CRISPR en lugar de clones, es posible aumentar la luminiscencia aumentando el número de células plateadas, hasta 100.000 células/pocillo en formato de 96 pocillos, o 40.000 células/pocillo en formato de 384 pocillos. Ensayos de degradación cinética utilizando células HiBiT CRISPR que expresan LgBiTEn el caso de las células de suspensión que ya contengan endurazina, que se incluyó en la fase de recubrimiento del punto 2.2., proceda directamente al paso 2.3.3. Para líneas celulares adherentes preparar solución Nano-Glo Endurazina. Para el formato de 96 pocillos, prepare una solución 1x de endurazina diluyendo el reactivo madre 1:100 en un medio independiente delCO2 suplementado con FBS al 10%. Para el formato de 384 pocillos, prepare una solución 2x de endurazina diluyendo el reactivo madre 1:50 en un medio independiente delCO2 suplementado con FBS al 10%. Agregue la solución de endurazina a cada pocillo de células adherentes. Para el formato de 96 pocillos aspirar medio y añadir 90 μL de 1x solución de endurazina. Para el formato de 384 pocillos, agregue 18 μL de solución de endurazina 2x a 18 μL de células. No aspirar el medio, ya que el ensayo de degradación se realiza en una mezcla 50:50 de medio de cultivo y medio independiente deCO2 en formato de 384 pocillos. Incubar placas celulares en suspensión o adherentes que contengan endurazina durante 2,5 h en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 para permitir que la luminiscencia se equilibre. Preparar una concentración 10x de valoración PROTAC de prueba en medio independiente delCO2 y añadir 10 μL a cada pocillo de placa de 96 pocillos o 4 μL para placa de 384 pocillos. Para compuestos con eficacia desconocida, se recomienda una concentración final de 1-10 μM en el punto más alto como punto de partida. Recoger mediciones cinéticas de luminiscencia en luminómetro preequilibrado a 37 °C durante un período comprendido entre 0-48 h. Los incrementos de tiempo de medición se pueden personalizar para cada experimento, pero un experimento inicial recomendado serían las mediciones de luminiscencia cada 5-15 minutos durante 24 h o la cantidad de tiempo deseada. Análisis multiplex de viabilidad celular opcional del mismo pozo después de la medición cinética finalNOTA: Este ensayo se realiza con un kit CellTiter-Glo (CTG) disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).Equilibre el reactivo CTG a temperatura ambiente. Después de la medición de la degradación en el último punto de tiempo del análisis cinético, agregue 100 μL (placa de 96 pocillos) o 40 μL (placa de 384 pocillos) del reactivo por pocillo de la placa, y mezcle en un agitador de placas a 500-700 rpm (placa de 96 pocillos) o en un mezclador de vórtice de microplacas (placa de 384 pocillos) durante 5 min. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la lisis celular y el enfriamiento de la señal HiBiT. Mida la luminiscencia total en un luminómetro siguiendo las recomendaciones del fabricante. Cuantificación de perfiles de degradación cinéticaUsando las mediciones de luminiscencia cinética recolectadas, normalice las RLUs crudas para cada concentración de PROTAC a la condición DMSO promedio replicada en cada punto de tiempo para tener en cuenta los cambios en la concentración de furimazina libre a lo largo del tiempo. Calcule la RLU fraccional usando la Ecuación 1.Ecuación 1: A partir de las curvas de degradación, ajuste un modelo de decaimiento exponencial de un solo componente utilizando la Ecuación 2 a la porción de degradación inicial de cada curva hasta el punto donde los datos alcanzan una meseta.NOTA: Puede ser útil excluir del ajuste los primeros puntos de datos, ya que puede haber un breve retraso antes de que se observe la degradación.Ecuación 2: A partir de la Ecuación 2, determine el parámetro ƛ, que representa la constante de la tasa de degradación y la meseta, que representa la menor cantidad de proteína restante. Calcule Dmax, que es la cantidad fraccionaria máxima de proteína degradada y se calcula como 1-meseta. Trazar Dmax para cada concentración de PROTAC para determinar una curva de potencia de degradación independiente del tiempo. Determine el valor Dmax50 para la gráfica en 2.3.5 para analizar la eficacia de los compuestos.NOTA: Para determinar una CC50 en un punto de tiempo específico, trace el porcentaje de degradación calculado para cada concentración en el momento elegido. Esto se puede especificar como DC 50 t = 4 h o DC50 t = 12 h.

Representative Results

Para demostrar el análisis de degradación lítica del punto final de concentración única, varias proteínas diana CDK; CDK2, CDK4, CDK7 y CDK10 se marcaron endógenamente con HiBiT en su extremo C en células HEK293 y se trataron con una concentración de 1 μM de la panquinasa PROTAC basada en Cereblon (TL12-18654 ) (Figura 1A). El nivel de proteína CDK se midió en diferentes puntos temporales y se determinó la RLU fraccional en relación con el control DMSO (Figura 1A). Cada proteína CDK mostró diferentes grados de degradación en respuesta al tratamiento compuesto y los diversos puntos de tiempo (Figura 1A). Para comprender cómo las proteínas CDK se compararon entre sí directamente en términos de pérdida de proteínas, las RLUs fraccionales en la Figura 1A se calcularon como porcentaje total de degradación y se graficaron para cada punto de tiempo en la Figura 1B. Esto muestra que incluso en los primeros momentos de tiempo, 2 o 4 h, algunos de los miembros de la familia CDK muestran altos niveles de degradación que continúan aumentando con el tiempo (Figura 1B). Para demostrar el análisis de degradación cinética, cada una de las proteínas miembros de la familia BET; BRD2, BRD3 y BRD4 se marcaron endógenamente con HiBiT en su extremo N en células HEK293 que expresan de manera estable la proteína LgBiT18. Estos fueron tratados con tres concentraciones diferentes de los PATAC pan-BET; el dBET650 basado en Cereblon (Figura 2A) y el ARV-77141 basado en BVS (Figura 2B). Las mediciones cinéticas se recolectaron durante un período de 24 horas, y a partir de los perfiles en cada concentración, las diferencias en la respuesta de los miembros de la familia BET son evidentes. La capacidad de BRD2 para iniciar una respuesta de recuperación más rápida después del tratamiento compuesto de degradación (Figura 2A, B) se ha observado previamente con otros PROTAC pan-BET y es probable que se deba a una respuesta de retroalimentación transcripcional competitiva para el proceso de degradación18. Tanto el análisis cinético como el de punto final se pueden realizar con tratamientos de respuesta a dosis compuesta completa. En la Figura 3 se muestran los perfiles cinéticos de degradación dosis-respuesta del tratamiento de células Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat que expresan de forma estable la proteína LgBiT con cuatro compuestos de pegamento molecular diferentes 2,26,55,57; lenalidomida (Figura 3A), iberdomida (CC-220) (Figura 3B), talidomida (Figura 3C) y pomalidomida (Figura 3D). Estos degradadores muestran diferencias significativas en la respuesta de degradación entre los compuestos, así como en toda la serie de concentraciones (Figura 3). Para evaluar cuantitativamente la degradación y el orden de clasificación de los compuestos en la Figura 3, se utilizaron los perfiles de dosis-respuesta para calcular los parámetros clave de degradación, incluida la tasa de degradación (Figura 4A), Dmax (Figura 4B) y Dmax50 (Figura 4B). Estos análisis muestran que la iberdomida (CC-220) y la pomalidomida tienen tasas de degradación inicial rápidas muy similares (Figura 4A), sin embargo, la iberdomida (CC-220) tiene la potencia más alta, como se ha visto previamente en estudios ortogonales55,57 (Figura 4B). Dado que Iberdomida exhibe una potencia tan alta, y todas las concentraciones ensayadas muestran una degradación superior al 50%, el valor Dmax50 obtenido para Iberdomida representa una estimación basada en la limitación para ajustar con precisión los datos. De los gráficos de la Figura 3C, D y Figura 4B, ni la lenalidomida ni la talidomida degradan el objetivo de Ikaros/IKZF1 hasta completarse en las concentraciones más altas probadas. Debido a la muy poca degradación observada con la talidomida, las trazas de degradación no pudieron ajustarse con precisión a un modelo de decaimiento exponencial, por lo tanto, la tasa de degradación no se cuantificó para este tratamiento. Para el degradador más potente, iberdomida (CC-220)55,57 (Figura 4B). Los ensayos multiplexores de viabilidad celular no mostraron pérdida en la viabilidad celular para las concentraciones ensayadas (Figura 4C). Figura 1: Degradación y toxicidad del criterio de valoración CDK con la panquinasa PROTAC, TL12-18654. (A) Panel selecto de proteínas diana CDK endógenas fusionadas con HiBiT en el extremo C mediante CRISPR/Cas9 y evaluadas para su degradación con 1 μM TL12-186 PROTAC 54 a las 2 h, 4 h, 8 h y24 h de tratamiento. Los valores se representan como RLU fraccional en relación con un control DMSO medido en cada punto de tiempo. Las barras de error representan SD de la media de 3 réplicas técnicas. (B) Porcentaje de degradación del panel de proteínas diana CDK calculado a partir de (A) que representa la cantidad de degradación de cada miembro de la familia observada en puntos de tiempo de 2, 4, 8 y 24 h. Las barras de error representan SD de la media de 3 réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Perfilado de la selectividad de degradación cinética de miembros de la familia BET con degradadores BET, dBET650 y ARV-77141. Perfiles de degradación cinética de miembros endógenos de la familia BET, BRD2, BRD3 y BRD4, marcados con HiBiT en el extremo N mediante CRISPR/Cas9 con tratamiento de concentraciones únicas de 1 nM (izquierda), 10 nM (medio) o 100 nM (derecha) dBET650 (A) o ARV-77141 (B) PROTACs. Los valores se representan como RLU fraccional calculada a partir de un control DMSO en cada punto de tiempo cinético. Las barras de error representan SD de la media de 4 réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Perfiles de dosis-respuesta de degradación cinética de células vivas de Ikaros/IKZF1-HiBiT con un panel de pegamento molecular 2,26,55,57. Las células de Jurkat que expresan de manera estable la proteína LgBiT se diseñaron utilizando CRISPR / Cas9 para marcar el extremo C de Ikaros / IKZF1 con el péptido HiBiT. Las células se trataron con una serie de concentración de respuesta a la dosis de 8 puntos que incluía DMSO de cuatro compuestos de pegamento molecular diferentes 2,26,55,57: (A) lenalidomida, (B) iberdomida (CC-220), (C) talidomida o (D) pomalidomida. La luminiscencia se midió cada 5 min durante un total de 19,5 h. Los datos de la unidad de luz relativa (RLU) de (A-D) se convirtieron a RLU fraccionaria como se describe en el Paso 2.4.1 y se graficaron en función del tiempo. Las barras de error representan SD de 3 réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Cálculo de la tasa de degradación y Dmax50 para Ikaros/IKZF1-HiBiT, y ensayos de salud celular de multiplexación. Los datos de degradación cinética de la Figura 3 se utilizaron para calcular los parámetros cuantitativos de degradación. (A) Las tasas de degradación y (B) los valores máximos de degradación (Dmax) se grafican en cada concentración de fármaco para los compuestos de pegamento molecular indicados 2,26,55,57. (B) Los valores de Dmax50 para cada compuesto se calcularon utilizando un modelo dosis-respuesta con pendiente de Hill restringida de 1, que se puede usar para clasificar los compuestos de degradación de orden para un objetivo. (C) Los ensayos de viabilidad celular con la respuesta a la dosis de degradación de iberdomida (CC-220)55,57 de la Figura 3B se realizaron como una medición de punto final al finalizar las mediciones de degradación cinética. Las barras de error representan SD de 3 réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Presentamos aquí dos métodos de detección de la actividad compuesta de degradación en formato lítico de punto final o modo cinético de células vivas. Estos enfoques se basan en los mismos principios de medición luminiscente, pero proporcionan diferentes niveles de detalle y comprensión. La elección de cualquiera de los enfoques probablemente dependerá de los objetivos de detección y el tamaño de la biblioteca de compuestos. Para que las grandes plataformas de cribado compuesto o las pantallas primarias observen cualquier degradación detectable, el cribado lítico de punto final ofrece una compatibilidad sensible y eficiente de alto rendimiento donde otros enfoques de punto final, como el western blot o la espectrometría de masas, pueden ser poco prácticos o difíciles de adaptar¹⁴. Un punto de partida para estas pantallas podría realizarse con un número limitado de concentraciones y puntos de tiempo. Las concentraciones iniciales recomendadas para probar están en el rango de 100 nM-10 μM, para tener en cuenta los degradadores iniciales que tienen baja potencia, poca permeabilidad o, en algunos casos, con compuestos altamente potentes, la presencia de un efecto gancho. Se recomienda además que se pruebe un mínimo de dos puntos temporales diferentes para establecer la degradación de inicio temprano a las 4-6 h y la degradación latente o sostenida a las 18-24 h. Los compuestos que exhiben alta potencia de degradación y mecanismo en el objetivo se observan fácilmente dentro de un marco de tiempo de 4-6 horas, mientras que la degradación o pérdida aparente de proteínas observada solo en puntos de tiempo posteriores podría deberse a una variedad de mecanismos. Se recomienda encarecidamente controlar la viabilidad celular tanto en los puntos de tiempo tempranos como en los tardíos, de modo que la pérdida de proteínas pueda desacoplarse de la pérdida debido a la muerte celular. Al igual que cualquier tipo de ensayo luminiscente o fluorescente, existe la posibilidad de que los compuestos dentro de las bibliotecas interfieran o inhiban la señal, por lo tanto, los experimentos de seguimiento ortogonal con compuestos principales utilizando fusiones no relacionadas o enfoques alternativos para monitorear el nivel de proteína serán importantes para evaluar que la pérdida de RLU en estos ensayos se asocia directamente con la degradación de la proteína diana.

La capacidad de cribado en formato cinético de células vivas durante largos períodos de tiempo depende en gran medida de la señal de ensayo a fondo (S: B). Los factores que contribuyen a S: B incluyen el nivel de expresión de la proteína diana en sí, que puede abarcar varios órdenes de magnitud, la eficiencia de la expresión de LgBiT en la línea celular elegida para la inserción de péptidos, y la disponibilidad del target marcado para su complementación en sus diversos complejos nativos. Hemos establecido un requisito de corte general que consiste en un S: B de 15 para medir con éxito la degradación en modo cinético con Endurazina o Vivazina. El S:B se determina midiendo la señal basal de las células editadas con HiBiT que coexpresan LgBiT en relación con las células parentales no editadas que expresan LgBiT solo en presencia de sustratos de células vivas de Endurazina o Vivazina. Vivazine producirá una señal luminiscente más alta, pero decaerá más rápido que la endurazina y puede limitar la adquisición de señal a 24 horas o menos. Además, S:B también puede depender en gran medida de si se utilizan grupos CRISPR o clones. Para objetivos en líneas celulares que son más susceptibles y tienen una alta eficiencia para la ingeniería CRISPR / Cas9, una población heterogénea de células editadas en el grupo CRISPR puede tener suficiente S: B para el análisis cinético. Para objetivos en líneas celulares más difíciles donde la integración genómica menos eficiente a través de CRISPR da como resultado grupos con bajo S: B, podría ser necesario aislar clones CRISPR para enriquecer las poblaciones editadas y lograr un S: B suficientemente alto para el análisis cinético. Para cualquiera de estos escenarios, si S:B es inferior a 15 con sustratos de endurazina o vivazina, se recomienda el cribado lítico de punto final.

Para una mejor comprensión y caracterización de los compuestos, incluida la determinación de un perfil de degradación con parámetros cuantitativos, el análisis cinético en tiempo real en células vivas es el enfoque de detección recomendado^14,18. Al igual que el análisis de punto final discutido anteriormente, el cribado cinético inicial se puede realizar con un número limitado de concentraciones en el rango de 100nM-10μM en forma de alto rendimiento. En formato de 384 pocillos, más de 100 compuestos pueden cribarse fácilmente por triplicado a una concentración en una sola placa. Los perfiles de degradación resultantes proporcionarán orientación no solo sobre el grado de degradación observado, sino también sobre la tasa de degradación, la duración de la degradación y la recuperación potencial de la proteína^14,18 (Figura 2 y Figura 3). Las formas del perfil de degradación también proporcionan información valiosa. Los degradadores específicos y potentes a menudo muestran una rápida pérdida inicial de la proteína diana a una meseta en cuestión de horas^18,53, mientras que otros mecanismos como la retroalimentación transcripcional o la toxicidad del compuesto suelen dar lugar a una pérdida más lineal de la proteína con el tiempo. Estos detalles y matices se pierden con el análisis lítico de punto final, y con el análisis en tiempo real durante 24-48 horas, uno no tiene que predecir el tiempo para capturar el verdadero Dmax dentro de conjuntos de compuestos nuevos o desconocidos.

La cinética en tiempo real también permite un cribado eficiente de la respuesta a la dosis para comprender mejor la eficacia del compuesto, cómo la concentración del compuesto afecta la tasa de degradación inicial y ofrece posibilidades para clasificar los compuestos en función de más de un parámetro. Las mediciones clásicas de la potencia de degradación implican cálculos DC₅₀ en un punto específico en el tiempo basado en máximos de degradación aparentes. En contraste, nuestro enfoque cinético para evaluar la potencia incorpora el máximo de degradación real en cada concentración, independientemente de cuándo ocurra en el tiempo¹⁸. Llamamos a esta medida de la potencia de degradación cinética, el Dmax₅₀¹⁸. El análisis de esta manera explica los compuestos que pueden iniciar la degradación más lentamente a concentraciones más bajas y, por lo tanto, tomar más tiempo después del tratamiento para alcanzar su Dmax. Puede ser especialmente informativo clasificar los compuestos tanto en la tasa de degradación como en Dmax. Para los degradadores más potentes, esto diferenciará aún más los degradadores lentos pero potentes de aquellos que son rápidos y potentes. Juntos, el cribado cinético de células líticas y vivas utilizando líneas celulares HiBiT CRISPR son enfoques poderosos que producen una imagen más completa de la degradación de proteínas específicas, la función del compuesto y permiten el proceso de detección desde la evaluación inicial de la actividad hasta la optimización química posterior a través de la mejora de los parámetros clave de degradación.

Materials

CellTiter-Glo 2.0 reagent	Promega	G9241	Cell Viability luminescent assay
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay	Promega	G6080	Cell Viability fluorescent assay
CO2-independent medium	ThermoFisher	18045-088	Cell culture
DMSO	Sigma Aldrich	D2650	For compound dilution and control
DPBS	Gibco	14190	Cell culture
Fetal Bovine Serum	Seradigm	89510-194	Cell culture
HEK293 LgBiT stable cell line	Promega	N2672	For complementation with HiBiT to generate luminescence
HiBiT CRISPR mammalian cell line	Promega		https://www.promega.com/crispr-tpd
Hygromycin B solution	Gibco	10-687-010	Cell culture
LgBiT BacMam	Promega	CS1956C01	For complementation with HiBiT to generate luminescence
LgBiT Expression Vector	Promega	N2681	For complementation with HiBiT to generate luminescence
Luminometer Plate Reader			Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine live cell substrate	Promega	N2570	Kinetic HiBiT reagent
NanoGlo Vivazine live cell substrate	Promega	N2580	Kinetic HiBiT reagent
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system	Promega	N3030	Enpoint lytic HiBiT reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)	ThermoFisher	11058-021	Cell culture
Tissue culture plates, white, 96 well plate	Costar	3917	Cell culture
Tissue culture plates, white, 384 well plate	Corning	3570	Cell culture
Trypsin/EDTA	Gibco	25300	Cell culture