Isolierung und Analyse von Plasmalipoproteinen durch Ultrazentrifugation

Summary

Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.

Abstract

Die Analyse von Plasmalipoproteinen und Apolipoproteinen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Diagnose von Dyslipidämie und Studien des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose. Obwohl es mehrere Methoden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen gibt, ist die Ultrazentrifugation immer noch eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Aufgrund seines intakten Trennverfahrens können die mit dieser Methode isolierten Lipoproteinfraktionen zur Analyse von Lipoproteinen, Apolipoproteinen, Proteomen und funktionellen Untersuchungen von Lipoproteinen mit kultivierten Zellen in vitro verwendet werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von sieben Lipoproteinfraktionen, einschließlich VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 und 1,21 g/ml) aus Kaninchenplasma unter Verwendung sequenzieller schwimmender Ultrazentrifugation. Darüber hinaus stellen wir den Lesern vor, wie man Apolipoproteine wie ApoA-I, ApoB und ApoE von SDS-PAGE und Western Blotting analysiert und repräsentative Ergebnisse von Lipoprotein- und Apolipoproteinprofilen mit hyperlipidemischen Kaninchenmodellen zeigt. Diese Methode kann ein Standardprotokoll für Ärzte und Grundlegende Wissenschaftler werden, um Lipoproteinfunktionen zu analysieren.

Introduction

Dyslipidämie ist der Hauptrisikofaktor für atherosklerotische Erkrankungen in der Welt. Hohe Konzentrationen von Lipoproteinen mit geringer Dichte (LDLs) und niedrige Konzentrationen von Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) sind eng mit einem hohen Risiko für koronare Herzerkrankungen (CHD)^1,2verbunden. Im klinischen Umfeld werden sowohl LDL-Cholesterin (LDL-C) als auch HDL-Cholesterin (HDL-C) routinemäßig mit einem automatisierten Analysator in einem klinischen^Labor3^,4gemessen. Trotzdem ist es wichtig, Lipoproteinprofile im Detail für die Diagnose von Dyslipidämie und die Untersuchung des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose bei menschlichen und experimentellen Tieren zu analysieren. Es wurden mehrere Methoden zur Analyse von Plasmalipoproteinen wie Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie [schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)], Elektrophorese durch Agarose und Polyacrylamidgele, Kernspinresonanz und selektive chemische Ausfällung mit Polyanionen und divalenten Kationen oder anderen Chemikalien beschrieben. In den 1950er Jahren schlug Havels Gruppe erstmals das Konzept der Lipoproteine vor, die durch Dichten mittels Ultrazentrifugation definiert wurden, und klassifizierte sie in Chylomicrons (CM), Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteine mit mittlerer Dichte (IDL), LDL und HDL⁵ und später wurde die Methode von anderen Gruppen^6,7weiter modifiziert. Bisher ist ultrazentrifugation die beliebteste und zuverlässigste Methode, während das praktische Protokoll noch nicht verfügbar ist. In diesem Artikel haben wir versucht, ein benutzerfreundliches Protokoll zur Isolierung eines kleinen Plasmamaßstabs mit sequenzieller Dichte schwebender Ultrazentrifugation zu beschreiben, die ursprünglich^{zuvor beschrieben}wurde 8 . Isolierung von sieben Plasma-Lipoproteinfraktionen [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1.10 und 1.21 g/mL)] ermöglicht es den Forschern, eine umfassende Analyse sowohl der Lipoproteine als auch ihrer kompositorischen Apolipoproteine^9,10,11zu machen. Die intakten sieben aufeinanderfolgenden Dichte-Lipoproteine können zur Analyse von Lipoproteinfunktionen und auch zur Analyse zellbasierter In-vitro-Strategien verwendet werden. Dieses Protokoll sollte sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Grundlagenforschung nützlich sein. Hier haben wir Kaninchenplasma als Beispiel verwendet, um diese Technik zu demonstrieren, während Plasma von anderen Arten auf die gleiche Weise angewendet werden kann.

Protocol

Alle Verfahren für Kaninchenstudien wurden mit Genehmigung des Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschusses der Universität Yamanashi (genehmigte Nummer: A28-39) durchgeführt. 1. Plasmatrennung von Kaninchenblut Bereiten Sie 1,5 ml Mikroröhrchen mit 15 l 0,5 M EDTA (pH 8,0) für die Blutentnahme vor. Legen Sie ein Kaninchen in einen Restrainer und punktieren Sie eine auriculare Zwischenschlagader mit einer 22-Spur-Nadel und sammeln Sie Blut in eine Röhre. Mi…

Representative Results

Mit diesem Protokoll isolierten wir Kaninchen-Lipoproteine mit 1 ml Plasma und erhielten sieben Dichtefraktionen. Isolierte Dichtefraktionen reichen aus, um Lipide und Apolipoproteine zu messen, wie oben beschrieben, für die meisten Forschungszwecke. Das gleiche Verfahren kann auch für die Isolierung von Plasma-Lipoproteinen von menschlichen und anderen Arten verwendet werden. Für kleine Tiere wie Mäuse ist gepooltes Plasma erforderlich. Abbildung 3 zeigt Lipoproteinprofile von Wildtypka…

Discussion

Hyperlipidämie ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Erkrankungen. Daher ist die Analyse von Plasmalipoproteinen nicht nur für die Diagnose von Dyslipidämie-Patienten wichtig, sondern auch wichtig für die Untersuchung molekularer Mechanismen des Lipoproteinstoffwechsels und der Arteriosklerose. In dieser Studie haben wir das Protokoll der Isolierung und Analyse von Plasma-Lipoproteinen beschrieben, das in Laboratorien angewendet werden kann, in denen Ultrazentrifugation verfügbar ist. Die …

Materials

22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell