Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik
Summary
Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.
Abstract
Peptidoglycan ist ein wichtiger Bestandteil bakterieller Zellwände und ein häufiges zelluläres Ziel für antimikrobielle Mittel. Obwohl Aspekte der Peptidoglykanstruktur bei allen Bakterien ziemlich konserviert sind, gibt es auch erhebliche Unterschiede zwischen Gram-Positiven/Negativen und zwischen den Spezies. Darüber hinaus sind zahlreiche Variationen, Modifikationen oder Anpassungen des Peptidoglykans bekannt, die innerhalb einer Bakterienart als Reaktion auf die Wachstumsphase und/oder Umweltreize auftreten können. Diese Variationen erzeugen eine hochdynamische Struktur, von der bekannt ist, dass sie an vielen zellulären Funktionen beteiligt ist, einschließlich Wachstum/Teilung, Antibiotikaresistenz und Vermeidung der Wirtsabwehr. Um die Variation innerhalb des Peptidoglykans zu verstehen, muss die Gesamtstruktur in ihre Bestandteile (sogenannte Muropeptide) zerlegt und auf die gesamte zelluläre Zusammensetzung untersucht werden. Peptidoglycomics verwendet fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Peptidoglykanzusammensetzung im Detail zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, die Erfassung von Muropeptid-Intensitätsdaten durch ein Flüssigkeitschromatographen-Massenspektrometer und die Differentialanalyse der Peptidoglykanzusammensetzung unter Verwendung der Bioinformatik.
Introduction
Peptidoglycan (PG) ist ein charakteristisches Merkmal von Bakterien, das dazu dient, die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Proteine und andere zelluläre Komponenten strukturell zu unterstützen 1,2. Das Rückgrat von PG besteht aus abwechselnd β-1,4-verknüpfter N-Acetyl-Muraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc)1,2. Jedes MurNAc besitzt ein kurzes Peptid, das am ᴅ-Lactylrest gebunden ist und mit benachbarten disaccharidgebundenen Peptiden vernetzt werden kann (Abbildung 1A,B). Durch diese Vernetzung entsteht eine netzartige Struktur, die die gesamte Zelle umfasst und oft als Sacculus bezeichnet wird (Abbildung 1C). Während der PG-Synthese werden Vorläufer im Zytoplasma erzeugt und durch Flippasen durch die zytoplasmatische Membran transportiert. Vorläufer werden anschließend durch Transglykosylase- und Transpeptidase-Enzyme, die die glykosidischen bzw. Peptidbindungen produzieren, in das reife PG eingebaut3. Einmal zusammengesetzt, gibt es jedoch zahlreiche Enzyme, die von den Bakterien produziert werden, die das PG modifizieren und/oder abbauen, um eine Reihe von zellulären Prozessen durchzuführen, einschließlich Wachstum und Teilung. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass verschiedene Modifikationen des PG anpassungsspezifische Anpassungen an den Stamm, die Wachstumsbedingungen und den Umweltstress verleihen, die mit der Zellsignalisierung, der antimikrobiellen Resistenz und der Immunevasion des Wirts in Verbindung gebracht wurden4. Eine häufige Modifikation ist beispielsweise die Hinzufügung einer C6-Acetylgruppe an das MurNAc, die Resistenz verleiht, indem sie den Zugang zu den Glykan-β-1,4-Bindungen an vom Wirt produzierte Lysozymenzyme einschränkt, die PG 4,5,6 abbauen. Bei Enterokokken verleiht die Substitution des terminalen ᴅ-Ala der Peptidseitenkette durch ᴅ-Lac eine größere Resistenz gegen das antimikrobielle Vancomycin 7,8.
Das allgemeine Verfahren zur PG-Isolierung und -Reinigung ist seit seiner Beschreibung in den 1960er Jahren relativ unverändertgeblieben 9. Bakterielle Membranen werden durch Wärmebehandlung mit SDS aufgelöst, gefolgt von enzymatischer Entfernung von gebundenen Proteinen, Glykolipiden und verbleibender DNA. Der gereinigte intakte Sacculus kann anschließend durch Hydrolyse der β-1,4-Bindung zwischen GlcNAc und MurNAc in die einzelnen Bestandteile aufgeschlossen werden. Dieser Aufschluss produziert GlcNAc-MurNAc-Disaccharide mit intakten strukturellen Modifikationen und/oder Vernetzungen, die als Muropeptide bezeichnet werden (Abbildung 1B).
Die Analyse der Zusammensetzung von PG wurde zunächst durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Trennung (HPLC) durchgeführt, um jedes Murropeptid zu reinigen, gefolgt von einer manuellen Identifizierung von Muropeptiden10,11. Dies wurde inzwischen durch die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) abgelöst, die die Nachweisempfindlichkeit erhöht und den manuellen Arbeitsaufwand für die Reinigung jedes einzelnen Murropeptids verringert. Die zeitaufwändige und komplexe Natur der manuellen Identifizierung von Muropeptiden ist jedoch ein limitierender Faktor geblieben, der die Anzahl der durchgeführten Studien reduziert. In den letzten Jahren hat sich mit dem Aufkommen von “omic”-Technologien die automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktion zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das eine schnelle Erkennung und Identifizierung einzelner Verbindungen in komplexen Proben aus sehr großen Datensätzen ermöglicht. Sobald die Merkmale identifiziert sind, vergleicht die bioinformatische Software statistisch die Variation zwischen den Proben mithilfe der Differentialanalyse, isoliert selbst minimale Unterschiede zwischen dem komplexen Datensatz und zeigt sie dem Benutzer grafisch an. Die Anwendung von Merkmalsextraktionssoftware für die Analyse der PG-Zusammensetzung wurde gerade erst erforscht 12,13,14 und mit der bioinformatischen Analyse 12 gekoppelt. Im Gegensatz zur Proteomik-Analyse, die von den leicht verfügbaren Proteindatenbanken profitiert, die die Peptidfragmentierung vorhersagen und eine vollautomatische Identifizierung ermöglichen, gibt es derzeit keine Fragmentierungsbibliothek für Peptidoglykomics. Die Merkmalsextraktion kann jedoch mit bekannten und vorhergesagten Strukturdatenbanken gekoppelt werden, um die Identifizierung von Murropeptid12 vorherzusagen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der LC-MS-basierten Merkmalsextraktion in Kombination mit einer Murropeptidbibliothek zur automatisierten Identifizierung und bioinformatischen Differentialanalyse der PG-Zusammensetzung vor (Abbildung 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, zum Nachweis von LC-MS und zur Analyse der Zusammensetzung unter Verwendung bioinformatischer Techniken. Hier konzentrieren wir uns auf gramnegative Bakterien und einige geringfügige Modifikationen sind erforderlich, um die Analyse grampositiver Bakterien zu ermöglichen.
Die Herstellung von Muropeptiden ist seit ihrer ersten Herstellung in den 1960er Jahren praktisch gleich geblieben 9,11,15.<sup…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jennifer Geddes-McAlister und Dr. Anthony Clarke für ihre Beiträge zur Verfeinerung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse des CIHR unterstützt, die an C.M.K. (PJT 156111) vergeben wurden, und durch einen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, der an E.M.A. vergeben BioRender.com wurde.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
Referencias
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