Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

Summary

Questo protocollo descrive la purificazione della tubulina da fonti di piccole/medie dimensioni come cellule coltivate o cervelli di topo singolo, utilizzando cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. La tubulina purificata è arricchita in specifici isotipi o ha specifiche modifiche posttraslazionali e può essere utilizzata in saggi di ricostituzione in vitro per studiare la dinamica e le interazioni dei microtubuli.

Abstract

Un aspetto importante degli studi sul citoscheletro microtubulo è lo studio del comportamento dei microtubuli negli esperimenti di ricostituzione in vitro. Consentono l’analisi delle proprietà intrinseche dei microtubuli, come la dinamica, e delle loro interazioni con le proteine associate ai microtubuli (POP). Il “codice di tubulina” è un concetto emergente che indica diversi isotipi di tubulina e varie modifiche posttraslazionali (PTM) come regolatori di proprietà e funzioni dei microtubuli. Per esplorare i meccanismi molecolari del codice della tubulina, è fondamentale eseguire esperimenti di ricostituzione in vitro utilizzando tubulina purificata con isotipi e PTT specifici.

Ad oggi, questo è stato tecnicamente impegnativo in quanto la tubulina cerebrale, che è ampiamente utilizzata negli esperimenti in vitro, ospita molte PTM e ha una composizione di isotipo definita. Quindi, abbiamo sviluppato questo protocollo per purificare la tubulina da diverse fonti e con diverse composizioni di isotipi e PTM controllate, utilizzando l’approccio classico dei cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Rispetto ai metodi esistenti basati sulla purificazione dell’affinità, questo approccio produce una tubulina pura e competente per la polimerizzazione, poiché la tubulina resistente alla polimerizzazione o alla depolimerizzazione viene scartata durante le successive fasi di purificazione.

Descriviamo la purificazione della tubulina dalle linee cellulari, coltivata in sospensione o come colture aderenti, e da cervelli di topo singolo. Il metodo descrive per la prima volta la generazione di massa cellulare sia in ambienti di sospensione che aderenti, la fase di lisi, seguita dalle successive fasi di purificazione della tubulina da cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione. Il nostro metodo produce tubulina che può essere utilizzata in esperimenti che affrontano l’impatto del codice di tubulina sulle proprietà intrinseche dei microtubuli e sulle interazioni dei microtubuli con le proteine associate.

Introduction

I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Danno alle cellule la loro forma, costruiscono mandrini meiotici e mitotici per la segregazione cromosomica e fungono da binari per il trasporto intracellulare. Per svolgere queste diverse funzioni, i microtubuli si organizzano in modi diversi. Una delle domande intriganti sul campo è comprendere i meccanismi molecolari che permettono ai microtubuli conservati strutturalmente ed evolutivamente di adattarsi a questa pletora di organizzazioni e funzioni. Un meccanismo potenziale è la diversificazione dei microtubuli, definita dal concetto noto come “codice di tubulina”^1,2,3. Il codice della tubulina comprende due componenti principali: l’incorporazione differenziale dei prodotti gene α e β-tubulina (isotipi di tubulina) nei microtubuli e le modifiche posttraslazionali della tubulina (PTM).

Dagli anni ’70, gli esperimenti di ricostituzione in vitro, combinati con tecniche di microscopia ottica in evoluzione, hanno aperto la strada a importanti scoperte sulle proprietà dei microtubuli: instabilità dinamica⁴ e tapis roulant^5,e i loro altri^{meccanismi e funzioni 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Quasi tutti gli esperimenti in vitro eseguiti finora sono stati basati su tubulina purificata dal tessuto cerebrale utilizzando cicli ripetuti di polimerizzazione e depolimerizzazione^16,17. Sebbene la purificazione dal tessuto cerebrale conferisa il vantaggio di ottenere tubulina di alta qualità in grandi quantità (di solito quantità di grammi), uno svantaggio importante è l’eterogeneità come tubulina purificata dal tessuto cerebrale è una miscela di diversi isotipi di tubulina ed è arricchita con molte PTT di tubulina. Questa eterogeneità rende impossibile delineare il ruolo di un particolare PTM o isotipo di tubulina nel controllo delle proprietà e delle funzioni dei microtubuli. Pertanto, la produzione di tubulina competente per l’assemblaggio con PTT di tubulina controllata e composizione omogenea dell’isotipo è essenziale per affrontare i meccanismi molecolari del codice della tubulina.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio per purificare la tubulina mediante cromatografia di affinità utilizzando il dominio TOG legante i microtubuli (gene sopraespresso tumorale) del lievito Stu2p¹⁸. In questo metodo, la tubulina nei lisati grezzi di cellule o tessuti viene passata attraverso una colonna in cui si lega al dominio TOG immobilizzato dalla matrice, che consente l’analisi dell’intero pool di tubulina di un dato campione, anche molto piccolo. Negli ultimi anni è stato descritto anche un approccio tanto atteso per purificare la tubulina ricombinante. Si basa sul sistema baculovirus, in cui un vettore bi-cistronico contenente geni α- e β-tubulina è espresso nelle cellule degli^{insetti 19}. Tuttavia, questo metodo è molto ingombrante e dispendioso in termini di tempo ed è quindi utilizzato principalmente per studiare l’impatto delle mutazioni della tubulina²⁰ e degli isotipi di tubulina^21,22,23 in vitro.

Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo che utilizza il consolidato e ampiamente utilizzato approccio di polimerizzazione-depolimerizzazione come progetto per generare tubulina con diversi livelli di modifica sia dalle linee cellulari che dal tessuto cerebrale del topo²⁴. In questa procedura, la tubulina viene pedalata tra la forma solubile (dimero di tubulina a 4 °C) e polimerizzata (microtubulo a 30 °C in presenza di guanosina 5′-trifosfato [GTP]). Ogni forma è separata attraverso fasi successive di centrifugazione: i dimeri di tubulina rimarranno nel supernatante dopo uno spin freddo (4 °C), mentre i microtubuli saranno pellettati a 30 °C. Inoltre, una fase di polimerizzazione viene effettuata ad alta concentrazione di piperazina-N,N′-bis(acido 2-etanosolfonico) (PIPES), che consente la rimozione delle proteine associate ai microtubuli dai microtubuli e quindi dalla tubulina infine purificata. La tubulina purificata dalle cellule HeLa S3 coltivate come colture sospese o aderenti è praticamente priva di qualsiasi PTM di tubulina ed è stata utilizzata in recenti esperimenti di ricostituzione in vitro^25,26,27,28. Abbiamo ulteriormente adattato il metodo per purificare la tubulina dal cervello di un singolo topo, che può essere utilizzato per un gran numero di modelli di topi con cambiamenti negli isotipi di tubulina e nelle PTT.

Nel protocollo, descriviamo prima la generazione del materiale sorgente (massa cellulare o tessuto cerebrale), la sua lisi (Figura 1A), seguita dai successivi passaggi di polimerizzazione della tubulina e depolimerizzazione per purificare la tubulina (Figura 1B). Descriviamo inoltre il processo di valutazione della purezza(figura 2A,B)e della quantità(figura 3A,B)della tubulina purificata. Il metodo può essere adattato per produrre tubulina arricchita con un PTM selezionato sovraesprimendo un enzima modificante nelle cellule prima della purificazione della tubulina (Figura 4B). In alternativa, gli enzimi che modificano la tubulina possono essere aggiunti alla tubulina durante il processo di purificazione. Infine, possiamo purificare la tubulina priva di isotipi specifici o PTM dal cervello di topi carenti nei corrispondenti enzimi che modificano la tubulina (Figura 4B)²⁹.

Il metodo che descriviamo qui ha due vantaggi principali: (i) consente la produzione di quantità sufficientemente grandi di tubulina in un tempo relativamente breve, e (ii) genera tubulina pura di alta qualità, con una specifica composizione di isotipo di tubulina o PTT. Nel video associato di questo manoscritto, evidenziamo alcuni dei passaggi critici coinvolti in questa procedura.

Protocol

La cura e l’uso degli animali per questo studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Comunità europea (2010/63/UE). Le procedure sperimentali sono state specificamente approvate dal comitato etico dell’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorizzazione n. 04395.03 concessa dall’Autorità Nazionale) nel rispetto delle linee guida internazionali. 1. Preparazione dei reagenti per la purificazione della tubulina NOTA: Tutti i tamponi utilizzati per la…

Representative Results

L’obiettivo principale di questo metodo è quello di produrre tubulina di alta qualità e competente per l’assemblaggio in quantità sufficienti per eseguire ripetuti esperimenti in vitro con i componenti purificati. I microtubuli assemblati da questa tubulina possono essere utilizzati in test di ricostituzione basati sulla tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) con microtubuli dinamici o stabili, in esperimenti che testano la dinamica dei microtubuli, le interazioni con MAP o motori mo…

Discussion

Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma per generare rapidamente tubulina di alta qualità e competente per l’assemblaggio in quantità medio-grandi dalle linee cellulari e dal cervello di un singolo topo. Si basa sul protocollo gold-standard di purificazione della tubulina dal cervello bovino utilizzato sul campo per^{molti anni 16,17}. Un vantaggio particolare dell’approccio è l’uso di colture di sospensione delle cellule HeLa S3, che, una volta stabilit…

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C