後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング
Summary
ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。
Abstract
ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。
Introduction
ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御1,2,3、生殖細胞発生4,5、piRNA生物学6、7、8、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象9、10、11、12、13に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18。しかし、このモデルのライブイメージングは成体組織と初期胚期に限定されており、ニッチが最初に形成され機能し始めている正確な段階である後期胚の生殖腺動態に関する知識にギャップを残しています。
後期胚性生殖巣は球体であり、前部の体細胞ニッチ細胞と、より後方領域19全体にわたって体性生殖腺細胞によって嚢胞された生殖細胞とからなる。この器官は、初期段階17から17、20、21の初期胚までインビボで生きて画像化することができる。さらに、大規模な筋肉収縮の開始により画像化が妨げられる。これらの収縮は非常に深刻で、生殖腺を画像フレームから押し出すため、そのような動きは画像化ソフトウェアでは補正できません。私たちの研究室では、ライブイメージングのためのこのとらえどころのない時期に起こるニッチ形成のメカニズムを明らかにすることに興味を持っています。そこで、胚期16から生殖巣を生きた画像化するエクスビボアプローチを生かし、生殖腺発生のこの重要な時期における細胞ダイナミクスの研究を促進しました。私たちの研究室の以前の研究は、このex vivoイメージングがin vivo生殖腺発達を忠実に再現することを示しています17。この技術は、ショウジョウバエの胚性生殖腺にとってその種の最初で唯一のものです。
ここでは、後期胚期における生殖巣のエクスビボライブイメージングに必要な解剖プロトコルを提示する。このプロトコールは、薬理学的処置、または生殖腺内の特定の細胞系譜のトランスジェニック操作と組み合わせることができる。この技術を用いて、幹細胞ニッチ形成17のステップを画像化することに成功した。したがって、このイメージングアプローチは、自然環境内でニッチ形成の初期段階をリアルタイムで視覚化できるため、幹細胞生物学の分野にとって有益です15,17。この方法は幹細胞生物学の分野にとって有益であるが、細胞再配列22、細胞接着2、12、23、および細胞遊走23を含む、この発生時点の間に生殖腺で起こる任意の動的プロセスを視覚化するためにさらに適用可能である。したがって、この解剖プロトコルは、多くの基本的な細胞生物学的プロセスに関する私たちの理解を深めるでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣15内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮17の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロト?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この議定書の早期開発に多大な貢献をしたLindsey W. PlasschaertとJustin Suiに感謝したい。著者らは、試薬に対する寛大さ、特にルース・レーマンとベンジャミン・リンが、出版前に Nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3’ラインを贈呈したことに感謝しています。ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)から得られたストックを本研究に使用した。この作業は、NIH RO1 GM060804、R33AG04791503、R35GM136270(S.D.)、およびトレーニング助成金T32GM007229(B.W.)およびF32GM125123(L.A.)によって支援されました。
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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