Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.
Conventionele intracellulaire micro-elektrodetechnieken om cardiomyocytenelektrofysiologie te kwantificeren zijn uiterst complex, arbeidsintensief en worden meestal uitgevoerd in lage doorvoer. Snelle en voortdurende uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) vormt een nieuwe standaard in cardiovasculair onderzoek en alternatieve methoden zijn nu nodig om de doorvoer van elektrofysiologische gegevens op een enkel celniveau te verhogen. VF2.1Cl is een recent afgeleide spanningsgevoelige kleurstof die een snelle eenkanaals, hoge magnitude respons biedt op fluctuaties in membraanpotentiaal. Het bezit een kinetiek die superieur is aan die van andere bestaande spanningsindicatoren en stelt functionele gegevens beschikbaar die gelijkwaardig zijn aan die van traditionele micro-elektrodetechnieken. Hier demonstreren we vereenvoudigde, niet-invasieve actiepotentiaalkarakterisering in extern getemporeerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een modulair en zeer betaalbaar fotometriesysteem.
Elektrofysiologische modellering van cardiomyocyten en de bouw van efficiënte platforms voor cardiale geneesmiddelenscreening is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor een verscheidenheid aan aritmische aandoeningen. Snelle uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie heeft veelbelovende inbraken in de menselijke ziekte modellering en farmacologisch onderzoek met behulp van geïsoleerde patiënt afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) geproduceerd. “Gouden standaard” -technieken voor elektrofysiologische karakterisering van deze cellen door middel van patch-clamp (current-clamp) kunnen de morfologie en duur van het actiepotentiaal (AP) kwantificeren, maar deze methode is ongelooflijk complex en traag en niet goed geschikt voor gegevensacquisitie met hoge doorvoer1. iPSC-CMs hebben regelmatig een verhoogd diastolisch membraanpotentiaal en verhoogde lekstroom in vergelijking met volwassen inheemse cardiomyocyten2. Er wordt gesuggereerd dat kleinere celgrootte en verminderde membraancapaciteit waargenomen in iPSC-CMs een systematische fout kunnen veroorzaken bij het gebruik van de stroomklemtechniek, misschien als verklaring voor deze afwijkingen3. Om het nut van een iPSC-CM-platform te maximaliseren, is een extra methode waardevol om de doorvoer te verhogen en de nauwkeurigheid van gegevens te garanderen bij het karakteriseren van transmembraanspanningsveranderingen op een enkel celniveau in iPSC-CMs.
Spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) zijn al lang een voorgestelde methode om een snellere, niet-invasieve en gelijkwaardige analyse van cardiale AP-kinetiek te bieden in vergelijking met die van traditionele technieken4. Een recente studie heeft de geschiktheid aangetoond van ratiometrische spanningsgevoelige sondefotometrie om de cardiale AP5nauwkeurig te kwantificeren. Bovendien leent de mogelijkheid om optische fotometriebenaderingen gemakkelijk op te schalen deze techniek aan grootschalige cardiotoxiciteitsscreenings die van cruciaal belang zijn bij de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen (bijv. CiPA). Ontwikkeling van gestandaardiseerde cardiotoxiciteitsprotocollen in een geblindeerde multi-site studie met behulp van micro-elektrode array en spanningsgevoelige optische technieken heeft de belangrijkste waarde van deze aanpak aangetoond6.
Veel potentiometrische kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar en de voortdurende synthetische ontwikkeling van nieuwe sondes toont een opwindend potentieel voor het stroomlijnen van hun effectiviteit in een verscheidenheid aan cardiale en neurale constructies. De ideale VSD heeft een verhoogde kinetiek en gevoeligheid, terwijl de capacitieve belasting, fotobleaching en cytotoxiciteit afnemen. De onlangs gesynthetiseerde VF2.1Cl (FluoVolt) drukt veel van deze gunstige eigenschappen uit, grotendeels te danken aan de nieuwe draadgebaseerde moleculaire structuur, gedeeld door andere leden van de nieuwe VoltageFluor (VF) -familie7. In tegenstelling tot gewone elektrochrome VSD’s waarin eenvoudige sondes moleculair en elektrisch conjugeren met het plasmamembraan, bestaat deze kleurstof uit een passief ingebrachte, membraanoverspannende synthetische draad die een elektronrijke donor koppelt aan een gemodificeerde fluoresceïnefluoofoor (FITC). Mechanistische details zijn te vinden in figuur 1. Deze kleurstof toont een uitstekende gevoeligheid voor membraanspanningsfluctuaties en vertoont een verandering van 27% in emissie-intensiteit per 100 mV in tegenstelling tot ~ 10% gezien in andere veel voorkomende sondes bij vergelijkbare snelheden7. Bovendien hebben draadgebaseerde PeT-systemen geen directe interactie met het cellulaire elektrische veld, wat minimale elektrische interferentie en verwaarloosbare veranderingen in cellulaire capacitieve belasting produceert.
Figuur 1: Chemische, spectrale en mechanistische parameters van VF2.1Cl kleurstof. (A) Chemische structuur van VF2.1Cl. Moleculaire kenmerken om op te merken omvatten meerdere alkylgroepen in de fenyleenvinyleen moleculaire draad die het inbrengen in het plasmamembraan vergemakkelijken. Een negatief geladen sulfonzuurgroep geconjugeerd aan de FITC-sonde zorgt voor fluorofoorstabilisatie op het extracellulaire oppervlak en helpt bij het bijna loodrecht inbrengen ten opzichte van het elektrische veld van de lipide dubbellaag. B)Een vereenvoudigd schema van loodrechte VF2,1Cl inbedding in het plasmamembraan van een doelcel. (C) Absorptie- en emissiespectra van VF2.1Cl kleurstof. Spectra is identiek aan die van standaard FITC- en GFP-sondes. D)Weergave van het mechanistische werkingsmechanisme van VF2.1Cl. In rustomstandigheden (hyperpolarisch) drijven negatieve intracellulaire spanningen vrije elektronen naar de rostrale fluorofoor. Elektronenrijkdom zorgt ervoor dat foto-geïnduceerde elektronenoverdracht (PeT) de voorkeur krijgt als een pad uit de aangeslagen toestand na de optische excitatie, waardoor fluorescentie effectief wordt geblust. Daarentegen beïnvloedt een gedepolariseerde membraanpotentiaal de neerwaartse elektronenbeweging ten gunste van fluorescentie bij optische excitatie. De resulterende fluorescerende respons is lineair gerelateerd aan membraanspanning en kan nauwkeurig worden gebruikt om gedetailleerde temporele informatie over cellulaire elektrofysiologische kinetiek te verzamelen. (E) Representatieve brightfield (bovenste) en fluorescentie bij 470 nm (onderste) beelden van leporine cardiomyocyten geladen met VF2.1Cl. (F) Z stack van een enkele geladen cardiomyocyt. Pijlen geven gebieden aan met een duidelijke lokalisatie van VF2.1Cl naar het celmembraan. Beelden werden verkregen met een ronddraaiend schijf confocaal systeem bestaande uit een X-lightv3 draaiende schijf confocale kop met een 50 μm pinhole patroon; LDI-7 verlichting; Prime95B camera en een PlanApo Lambda 100x objectief. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De FITC-sonde geconjugeerd aan VF2.1Cl zorgt ervoor dat deze effectief kan worden gebruikt onder standaard- en GFP-filterconfiguraties, en vereist slechts een enkelkanaals acquisitiesysteem, die beide gemeenschappelijke kenmerken zijn van fluorescerende beeldvormingsplatforms. Analyse van dichte menselijke iPSC-CM monolagen met deze kleurstof is onlangs gemeld8,9,10,11. Ons protocol verschilt van deze studies vanwege ons onderzoek naar enkele, geïsoleerde iPSC-CMs, niet gestoord door de elektrische en paracriene invloeden van dichte syncytiele monolagen, en ons gebruik van een betaalbaar en aanpasbaar fotometriesysteem in tegenstelling tot complexe confocale of wide-field beeldvormingsarrangementen.
Hier beschrijven we ons protocol voor de snelle verwerving en analyse van robuuste optische AP’s van geïsoleerde menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten en inheemse cardiomyocyten (zie Aanvullend bestand). We gebruiken VF2.1Cl in combinatie met een aanpasbaar state-of-the-art platform voor fotometriemetingen met één cel. Deze experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Göttingen (nr. 10/9/15).
Hier beschrijven we een basisprotocol om eenvoudig gedetailleerde AP-profielen te verkrijgen van geïsoleerde iPSC-CMs die geschikt zijn voor elektrofysiologische modellering en cardiale geneesmiddelenscreening. We detecteren regelmatige, robuuste AP’s van onze schaars gezaaide iPSC-CMs, wat zowel indicatorfunctionaliteit als methodologische betrouwbaarheid suggereert.
Vanwege het brede spectrum van commerciële methodologieën voor iPSC-herprogrammering en het gebrek aan standaardisatie voor …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Cairn Research Ltd. bedanken voor hun vriendelijke financiële bijdrage die de productiekosten van deze publicatie dekte. Daarnaast bedanken we mevrouw Ines Mueller en mevrouw Stefanie Kestel voor hun uitstekende technische ondersteuning.
Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 en in het kader van de Duitse Excellence Strategy – EXC 2067/1- 390729940) en de Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Reagents | |||
0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
Matrigel | BD | 354230 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
Equipment | |||
495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
ET535/50m | Chroma Technology | ||
Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
Filter Cubes | Cairn Research | ||
IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
MonoLED | Cairn Research | ||
Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
Optomask Shutter | Cairn Research | ||
Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
Software | |||
Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
Prism 8 | Graphpad |