We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .
Xenopus laevis ei-extracten, die traditioneel worden gebruikt voor biochemische bulktests, zijn naar voren gekomen als een krachtig op beeldvorming gebaseerd hulpmiddel voor het bestuderen van cytoplasmatische verschijnselen, zoals cytokinese, mitotische spindelvorming en assemblage van de kern. Voortbouwend op vroege methoden die vaste extracten in beeld brachten die op schaarse tijdstippen waren bemonsterd, beeldden recente benaderingen live-extracten af met behulp van time-lapse-microscopie, waarbij meer dynamische kenmerken met verbeterde temporele resolutie werden onthuld. Deze methoden vereisen meestal geavanceerde oppervlaktebehandelingen van het beeldvormende vat. Hier introduceren we een alternatieve methode voor live beeldvorming van ei-extracten die geen chemische oppervlaktebehandeling vereisen. Het is eenvoudig te implementeren en maakt gebruik van in massa geproduceerde laboratorium verbruiksartikelen voor beeldvorming. We beschrijven een systeem dat kan worden gebruikt voor zowel wide-field als confocale microscopie. Het is ontworpen voor het afbeelden van extracten in een 2-dimensionaal (2D) veld, maar kan eenvoudig worden uitgebreid naar beeldvorming in 3D. Het is zeer geschikt voor het bestuderen van ruimtelijke patroonvorming binnen het cytoplasma. Met representatieve gegevens demonstreren we de typische dynamische organisatie van microtubuli, kernen en mitochondriën in interfase-extracten die met deze methode zijn bereid. Deze beeldgegevens kunnen kwantitatieve informatie verschaffen over cytoplasmatische dynamica en ruimtelijke organisatie.
Het cytoplasma vormt het hoofdvolume van een cel en heeft een aparte organisatie. De ingrediënten van het eukaryote cytoplasma kunnen zichzelf assembleren tot een breed scala aan ruimtelijke structuren, zoals microtubule-asters en het Golgi-apparaat, die op hun beurt dynamisch worden gerangschikt en omgedraaid, afhankelijk van de identiteit en fysiologische toestand van de cel. Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie van het cytoplasma en de link met cellulaire functies is dus belangrijk om te begrijpen hoe de cel werkt. Xenopus laevis ei-extracten worden traditioneel gebruikt voor biochemische bulktests 1,2,3,4,5,6,7,8, maar recent werk vestigt ze als een krachtig live beeldvormingssysteem voor mechanistische studies van cytoplasmatische structuren en hun cellulaire functies 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Deze onverdunde extracten behouden vele structuren en functies van het cytoplasma, terwijl ze directe manipulaties van cytoplasmatische inhoud mogelijk maken die niet haalbaar zijn in conventionele celgebaseerde modellen 19,20. Dit maakt ze ideaal voor het karakteriseren van cytoplasmatische verschijnselen en het ontleden van hun mechanistische onderbouwing.
Bestaande methoden voor het afbeelden van extracten vereisen chemische oppervlaktemodificaties of fabricage van microfluïdische apparaten. Een op coverslip gebaseerde methode vereist polyethyleenglycol (PEG) passivering van glazen coverslips21. Een op micro-emulsie gebaseerde methode vereist dampafzetting van trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan op glasoppervlakken22,23. Microfluïdische systemen maken nauwkeurige controle van het volume, de geometrie en de samenstelling van extractdruppels mogelijk, maar vereisen gespecialiseerde microfabricagefaciliteiten 11,12,24.
Hier introduceren we een alternatieve methode voor het afbeelden van ei-extracten die gemakkelijk te implementeren is en gebruik maakt van direct beschikbare, goedkope materialen. Dit omvat de voorbereiding van een beeldkamer met een dia en een coverslip bedekt met gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) tape. De kamer kan worden gebruikt voor beeldvormingsextracten met een verscheidenheid aan microscopiesystemen, waaronder stereoscopen en rechtopstaande en omgekeerde microscopen. Deze methode vereist geen chemische behandeling van oppervlakken, terwijl een vergelijkbare optische helderheid wordt bereikt die wordt verkregen met bestaande op glas gebaseerde methoden die hierboven zijn besproken. Het is ontworpen om een laag extracten met een uniforme dikte over een 2D-veld af te beelden en kan eenvoudig worden uitgebreid om een 3D-volume aan extracten af te beelden. Het is zeer geschikt voor time-lapse beeldvorming van collectief cytoplasmatisch gedrag over een groot gezichtsveld.
We hebben interfase-arrested ei-extracten gebruikt om onze beeldvormingsmethode te demonstreren. Het extractpreparaat volgt het protocol van Deming en Kornbluth19. Kortom, eieren die van nature zijn gearresteerd in de metafase van meiose II worden verpletterd door een spin met lage snelheid. Deze spin bevrijdt het cytoplasma van meiotische arrestatie en laat het extract in de interfase gaan. Normaal gesproken wordt cytochalasine B toegevoegd voorafgaand aan de verpletterende spin om de vorming van F-actine te remmen. Het kan echter worden weggelaten als F-actine gewenst is. Cycloheximide wordt ook toegevoegd voorafgaand aan de breekspin om te voorkomen dat het interfase-extract de volgende mitose binnendringt. De extracten worden vervolgens in de eerder genoemde beeldvormende kamers geplaatst en op een microscoop gelegd. Ten slotte worden beelden in de loop van de tijd met gedefinieerde intervallen opgenomen door een camera die op de microscoop is aangesloten, waardoor time-lapse-beeldreeksen worden geproduceerd die het dynamische gedrag van het extract in een 2D-veld vastleggen.
Xenopus laevis ei-extracten zijn naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem voor op beeldvorming gebaseerde studies van verschillende subcellulaire structuren 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 en cytoplasmatische organisatie op een geheel </s…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken J. Kamenz, Y. Chen en W. Y. C. Huang voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 en R35 GM131792) toegekend aan James E. Ferrell, Jr.
17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |