닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

Summary

우리는 닭 배아의 망막에서 콘 광수용체의 1 차적인 배양을 얻고 높은 함량 검열을 위한 그것의 사용을 얻는 방법을 기술합니다.

Abstract

인간의 주간 시력은 망막의 중심에 있는 콘 광수용체의 기능에 의존합니다, 포베아. 상속된 망막 변성의 가장 널리 퍼진 양식에서 손해를 입는 환자, 망막 색소증, 막대 광수용체의 돌연변이 구동 손실 때문에 야간 시력을 분실합니다, 실명으로 이끌어 내는 원소의 기능 그리고 죽음의 점진적인 손실에 선행된 현상. 유전학자는 이 질병을 일으키는 원인이 되는 돌연변이를 가진 많은 유전자를 확인했습니다, 그러나 확인된 첫번째 돌연변이는 이차 원뿔 변성의 기계장치에 의문을 제기하고 막대에서 독점적으로 표현된 시각 안료를 위한 rhodopsin 유전자 인코딩에 있는 지배적인 돌연변이가 원뿔 변성을 시작할 수 있는 방법.

질병의 유전 모형에 있는 이식의 이 결과는 망상염 안료증의 모든 유전 양식에 있는 원소의 막대와 원자 사이 세포 상호 작용의 개념및 비 세포 자율 변성으로 이끌어 냈습니다.

콘은 인간에 있는 모든 광수용체의 5% 및 마우스에 있는 단지 3%를 구성합니다, 그래서 그들의 연구 결과는 이 종에서 어렵습니다, 그러나 cones는 조류 종의 막대를 능가합니다. 우리는 그들의 발달의 29 단계에서 닭 배아의 망막에서 문화 망막 전구체에 96 웰 접시를 적응했습니다. 이러한 1 차 배양에서, 원단점은 체외 분화 후 세포의 80 %를 나타냅니다. 세포는 혈청의 부재에 1 주일의 기간 동안 퇴화. 여기서는 방법과 표준화를 설명합니다.

이러한 원뿔농축 배양 시스템은 쥐 망막 색소 상피의 높은 함량 선별에 의해 상피 유래 원뿔 생존가능성 인자(EdCVF)를 규명하기 위해 사용되었다. 재조합 EdCVF는 원뿔의 변성을 방지합니다.

Introduction

척추 동물 종의 망막은 일광, 색상 및 시력 시력을위한 희미한 빛 시력과 콘 광수용체를위한 막대 광수용체와 함께 이중입니다. 영장류 시력은 망막의 중심에 있는 지역에 의존합니다, fovea에게 불린, 콘에 풍부합니다, 그러나 전반적으로, 콘은 모든 광수용체의 단지 5%를 나타냅니다. 따라서 영장류 망막의 콘 분석, 특히 콘 문화는 기술적으로 어렵습니다. 다른 모든 포유류 종에는 포베아가 없으며 망막 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 설치류의 경우 콘의 백분율이 낮습니다. 이것은 원종이 잘 보고 조류 종의 망막을 지배하는 조류 종의 경우는 아닙니다. 포유류가 진화 하는 동안 처음 나타났을 때 생태계를 지배 한 공룡은 조류^1의물리 유전학 기원에 있습니다. 공룡과 초기 포유류 사이의 이러한 경쟁의 결과로, 포유동물은 주로 막대에 의해 지배 망막과 야행성입니다. 진화 하는 동안 만 나중에 일부 포유류 종의 대지 비전, 영장류 속한 중, 진화 의 이점이 되었다. 그럼에도 불구하고, 조상 기간은 포유류 비전^2,3의 진화에 있는 야행성 병목 현상의 아타비즘으로 남아 있다^2,3.

망막 세포 분화를 공부하는 동안, 애들러와 Hatlee는 광수용체가 배아의 날(ED) 6 또는 스테이지 29^4에서닭으로부터 유래한 배양에서 망막 분화 세포의 약 70%를 나타낸다는 것을 보여주었다. 닭망막에 콘의 보급으로 인해 ED6 닭 배아로부터망막 세포의 배양이 원뿔농축^배양5로개발되었다.

인간에 대한 원뿔 매개 시력의 중요성은 이타주의입니다. 원뿔 기능을 바꾸는 유전 또는 노화 질병에 의해 영향을 받은 사람들은 크게 장애가 있습니다. 이것은 이러한 눈부신 질병에 대한 치료를 찾는 목적으로 상속 된 망막 변성 (IRD)에 대한 연구의 매우 큰 몸을^{촉진하고있다 6,7.} IRD Leber 선천성 마우로증(LCA)의 가혹한 형태의 치료에 대한 재조합 아데노 관련 벡터(AAV)를 사용하여 얻은 첫 번째 성공은 유전자 치료에 대한 개념^{증명이다 8.} 돌연변이가 IRD를 유발하는 유전자의 식별은 유전자 치료를 사용하여 이러한 질병을 치료할 가능성을 열어줍니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 질병은 200개 이상의 뚜렷한 유전자^9에서돌연변이로 인해 발생한다. IRD의 상염색체 오목형태의 경우에도 병적 유전자의 정상적인 사본을 재도입하면 시각 기능을 복원할 수 있을 때, 각 개별 개발의 경제적 비용은 덜 일반적인 유전자에 해를 끼치는 것과 유전 기원이 알려지지 않은 사람들에게 가장 널리 퍼진 것들을 선호합니다. 이 사실은 더 일반적인 치료에 관하여 생각하는 연구원을 지도했습니다. 세포 사멸은 상염색체 지배적 형태를 포함하는 광수용체의 변성에 의해 진행되는 이들 질환의^{치료표적(10,11)으로}나타났다. 그러나 이러한 접근 방식의 성공은 누락되었습니다. IRD의 가장 일반적인 형태의 IRD, 망염 색소증(RP)의 경우, 일반적인 통로는 궁극적으로 콘^12,13의변성 뒤에 기능의 이차 손실이다. 원뿔 기능의 손실을 방지하는 것은 원인^{돌연변이(14)와}독립적으로 포베아의 중심 시력을 보존할 것이다.

RP의 초기 단계에서, 막대의 손실은 막대와 콘 사이의 대사 및 레독스 신호를 방해하는 뉴클레오레독신 과 같은 1(NXNL1)유전자에 의해 인코딩된 로드 유래 콘 생존능력인자(RdCVF)의 발현감소를 유발한다. NXNL1 유전자의 두 가지 제품을 인코딩하는 재조합 AAV의 투여, 영양 인자 RdCVF 및 티오레독신 효소 RdCVFL, 이론적으로 RP^16의모든 유전 적 형태의 원뿔 시력 손실을 방지 할 수 있습니다. 우리는 NXNL1 유전자 제품, RdCVFL, 닭 콘 농축 문화^(17)에서 발현되고 보호 역할^18을수행하는 곳을 보여주었다. RdCVF 및 NXNL1 유전자는 본관 농축 배양으로부터 세포의 생존을 이용한 망막 cDNA 라이브러리의 고함량 스크리닝에 의해^{판독(19)으로}확인되었다. 각 클론에 대해 8개의 병렬 테스트를 사용하여 라이브러리의 210,000개의 개별 클론을 선별했습니다. 이것은 생물학 물질, 닭 배아의 망막에 쉽게 접근을 요구하는 시험의 아주 다수 수를 나타냅니다. 우리는 계란 누워 암탉과 육류 생산 닭에 대한 농업 산업을 위해 널리 생산되기 때문에 매주 배아 닭 알을 얻는 것이 비교적 쉽다는 것을 발견했습니다. 원뿔이 풍부한 배양을 신중하게 표준화한 후, 이 시스템은 콘 생존 가능성을 보존하기 위해 수천 개의 분자를 쉽고 견고하며 재현가능한 방식으로 테스트할 수 있습니다. 이들 세포는 또한 신호 전과의 연구와 생화학적^{분석(21,22,} 23)에 유익한 유전자^{조작(20)에}대한 순종이다.

망막 연구원은 콘 세포주661W^24,25,26의사용으로 대체 방법을 개발했다. 그럼에도 불구하고, 이 세포선의 정체성은 논란의 여지가^27,28. 661W 세포는 인간 간 광수용체 레티놀 결합 단백질 프로모터의 통제하에 SV40 큰 T 항원을 발현하는 형질전환 마우스 라인의 망막 종양으로부터 복제되었다. SV40 대형 T 항원은 세포 변환 및 불멸을 중재합니다. 결과적으로, 661W 세포를 사용하여 확인된 신호 통로는 그(것)들의 원추에서 여러 가지 면에서 구별되는 변형되고 불멸한 세포주의 문맥으로 보고되어야 합니다. 그런 점에서, 원뿔 농축 배양 시스템은 1 차적인 뉴런, 더 생리적으로 관련있는 원뿔으로 이루어지고 있습니다.

마우스 망막의 진동 절개를 사용하여 광수용체의 순수한 배양을 얻을 수 있지만, 설치류의 외부 망막에서 콘의 매우 낮은 백분율은 원뿔 농축^{배양(29)을}생산하는 데 적합하지 않다. 돼지 망막에는 포베아가 없지만 콘^30에서매우 농축된 지역 중앙 집중식이라는 지역이 있습니다. 아르비칸이스 앙소르게이와 삼모미스 강박관념^31,32로망막 주전자 설치류에서 콘의 높은 비율은 가능한 해결책을 제공하지만 이러한 이국적인 종의 번식이 필요합니다. 현지 도살장에서 채취한 성인 돼지 눈은 광수용체^{생존(33)을}연구하는 데 사용되어 온 막대와 원두의 혼합된 배양을 생성하는 데 사용될 수 있다. 우아한 해결책은 땅콩 아글루티닌 (PNA) 렉틴을 사용하여 돼지 망막에서 콘을 미리 정화하는^{것입니다.} 그럼에도 불구하고 이 방법은 복잡성 때문에 대규모로 구현하기가 어렵습니다.

인간 유도만능 줄기세포(iPS)는 망막 이식에 사용될 수 있지만 원뿔농축^{배양(35,36)에}적응할 수 있는 콘 광수용체 세포 집단을 얻기 위한 가장 유망한 접근법을 제공한다. 전사 인자 NRL은 로드 광수용체^(37)에필요하기 때문에, Nrl/– 마우스는 단파 콘(S-cones)이 지배하는 망막을 가지고 있다. 불활성화는 iPS^{38,39로부터}인간의 분화에 의해 S-콘 농축 제제를 생산하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 가능한 방법은 갑상선 호르몬 신호를 사용하여 원뿔 분화를 촉진하는 것입니다^40. 인간 iPS로부터 원뿔이 풍부한 문화를 생산하기 위한 새로운 방법이 등장하고 있지만, 닭 배아는 현재 입증된^{방법(19)을}제공한다.

원뿔이 풍부한 문화는 복제^19를통해 RdCVF를 식별하는 데 중요한 역할을 했다. 이 시스템은 또한 RdCVF가 유산소^{글리코리시스(22)에}의한 포도당 섭취와 대사를 자극한다는 것을 입증하는 데 성공적으로 사용되었다. 또한 원뿔농축 배양은 NXNL1 ^{유전자(23)의}제2 산물인 RdCVFL의 보호 역할을 검증하기 위해 사용되었다. 최근에는, 이 시스템은 OTX2^41로유도된 망막 색소 상피 세포에 의해 분비된 분자를 보호하는 존재를 보여주기 위하여 이용되었다.

Protocol

이 프로토콜은 피에르 대학과 마리 퀴리 대학과 연구의 프랑스 사역의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다 (허가 번호: APAFIS #1028 2015070211275177). 동물 실험은 다음과 같은 승인하에 수행되었다: “인증 d’autorisation d’expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture 드 경찰 드 파리 (11 월 9 일 2011- 11 월 8 일 2016)”. 1. 수정란의 인큐베이션 공업 부화장에서 자연적으로 획득한 주간 수정란(균주 I 657, 빨간 라벨)을 수집합니다. 암탉에 의해 “누워”된 후 실험실에서 수정 란 (생물학적 제로)을 유지하십시오. 각 문화에 대해, 20°C에서 24시간 동안 7개의 수정란을 배양한 다음 37°C에서 136시간 동안 간헐적으로 경사를 되찾은 다음(한쪽에서 반대방향으로 2시간 동안 의진보운동, 4시간 주기)을 습한 챔버에서 배양한다. 2. 닭 배아의 회복 소독제로 7개의 계란의 표면을 씻으시다(예: Pursept A express). 달걀 껍질을 부러 뜨리려면 큰 직선 펜치로 껍질 상단에 구멍을 만듭니다. 그런 다음 껍질을 잘라 서 달걀에서 모자를 제거 하 고 부드러운 삶은 계란으로. 각 배아를 곡면으로 달걀 껍질에서 부드럽게 추출한 다음 멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 함유한 페트리 접시로 이전에 37°C로 가열하였다. 부드럽게 배아(초리온 또는 초리오알란토믹 멤브레인)를 둘러싸고 있는 봉투를 제거합니다. 햄버거와해밀턴(42)에대한 시각적 비교에 의해 각 배아의 개발 단계를 확인한다. 발달29단계에서 2개의 배아를 선택한다(그림1). 날개는 팔꿈치에 구부러져 있습니다. 칼라가 눈에 띄게 돋보입니다. 이 법안은 28단계보다 더 두드러지 않습니다. 이러한 선택된 배아의 눈을 이핵화하고 CO2-독립배지(Life technologies)로 이송한다.주의: 배아가 29단계에 있고, 28단계 또는 30단계(도1)에있지 않는 것이 매우 중요합니다. 그래서 두 개의 계란만 마지막으로 사용 되 더라도 적어도 7 개의 계란을 배양 할 필요가 있다. 초리온은 매우 얇기 때문에 구별하기가 어렵지만 배아와 매우 가깝기 때문에 배아를 건드리지 않고 제거해야합니다. 3. 망막의 해부 구부러진 집게로 선택된 배아를 참수하고 방출합니다. 4개의 눈을 CO2-독립배지로 옮기. 이 매체는 0.9 mM CaCl2 및 0.65 mM MgCl 2를 함유하고있다. 각막이 얼굴을 아래로 향하게 하고, 시신경이 실험자가 마주보고 있는 눈을 놓습니다. 두 개의 직선 집게를 사용하여 시신경에 구멍을 뚫습니다. 망막과 안료 상피 사이에 각 집게의 가지를 삽입한다(도2). 각 집게를 당기고 눈을 회전하여 망막에서 상피를 분리합니다. 렌즈와 유리체 다음에 각막을 제거합니다. pH 7.2에서 링거의 매체가 들어있는 페트리 접시에 네 개의 망막을 옮기.주의: 망막만 남아 있는지 확인하고 유리체와 남은 망막 색소 상피의 흔적을 제거하십시오. 4. 망막 세포 현탁액 준비 두 개의 직선 펜치를 사용하여 매우 작은 조각으로 네 개의 망막을 잘라. 링거의 매체로 망막 조각을 두 번 씻으시다. 링거의 매체로 두 번째 세척 후 망막 조각이 튜브 바닥에 떨어지도록하고 링거의 매체를 제거하십시오. 트립신용액(0.25%w/v)으로 37°C에서 20분간 망막 조각을 치료한다. 연속 흡입에 의해 10 분 후에 용액을 분산시하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 방전하고 망막 조각의 해리를 확인합니다. 10% 불활성화된 태아 종아리 혈청으로 보충된 배양 매체를 추가하여 반응을 중지하십시오. DNase I. DNase I. DNase를 첨가한 직후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 연속흡입 및 방전을 통해 세포 클러스터와 DNA를 분리하여 세포 현탁액을 배양한다. 화학적 정의된 배양 배지(CDCM)로 망막 세포 현탁액을 두 번 세척: 100 μg/mL 리놀레산/BSA로 보충된 덜벡코의 수정된 이글 매체 및 M199 배지의 동일한 부피, 0.86 μM 인슐린, 0.07 μM 이송린, 2.0 μM 프로게스테론, 0.28 μM 프로스타글란딘, 0.29 μM 프로스타글란딘, 0.29 μM Na2SeO3,182 μM putrescine, 3 mM 타우린, 4.7 μM 시티딘 5′-디포스포콜린, 2.7 μM 시티딘 5′-디포스포탄탄, 0.55 μM 하이드로코르티존, 0.03 μM 트리오티로닌, 1mM 나트륨 피루바테 및 20 μM 젠타마이신. 5. 망막 세포 시드 32.25 μg/cm 2의 폴리 L-리신과 함께 37°C에서 2시간 동안 투명한 바닥으로 검은 96웰 배양 플레이트2개를처리한다. M199 배양 배지로 이 플레이트를 두 번 헹구세요. CDCM의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 살아있는 세포를 염색하기 위해 셀 서스펜션 트라이팬 블루의 10 μL의 알리쿼트에 추가합니다. 세포 현탁액 시편을 혈성계(말라세즈의 세포 계수 챔버)에 추가합니다. 현미경의 밑에, 혈액 세포계의 4개의 행에 대하여 염색된 세포를 계산한 다음 1개의 행을 위한 평균 세포 수를 계산합니다 (즉, 40 제곱). 다음과 같은 방법을 적용하여 현탁액의 세포의 농도를 계산합니다: 현탁액의 셀/mL 수 = 연속셀 수(10제곱) x 10은 트라이판 블루 x 1,000을 이용한 혈변세포계 x 희석의 총 제곱 수(셀/mL로 결과를 표현하기 위해). CDCM을 사용하여 세포 현탁액을 두 개의 도금 밀도(1 x 105 셀/cm 2 및 2 x 105 세포/cm2)에 대응하는 2개의 농도(5.6 x 104 셀/mL 및 1.12 x 105 cells/mL)로 셀 현탁액을 가져옵니다. 두 개의 전처리 된 검정 96 웰 배양 판으로 두 세포 현탁액의 종자 50 μL. 플레이트의 오른쪽에서 왼쪽으로 멀티채널 파이펫을 사용하여 플레이트내의 셀을 분배하여 각 컬럼 간에 균질화하여 세포의 분포가 균일하도록 합니다. 분자 라이브러리의 50 μL을 추가합니다(예를 들어, cDNA 라이브러리에서 조건된 매체, 아래 참조)를 미리 정의된패턴(표 1)을사용하여 스크리닝한다. 미디어 변경 없이 5% CO2 에서 37°C에서 7일 동안 플레이트를 배양합니다. 6. 실행 가능한 셀 계산 플레이트의 각 웰에, 칼신 AM의 2.7 μM및 에디듐 호모디머의 0.3 mM을 추가합니다.참고: 칼신은 에디튬 호모디머로서 큰 분자에 침투할 수 없는 세포를 관통합니다. 살아있는 세포의 세포질에서, calcein는 내인성 에스테라아에 의해 가수 분해되고, 485 nm에서 흥분할 때 520 nm에서 방출하여 형광이 된다. 에티듐 호모디머는 죽은 세포에 DNA에 결합. 에티듐 DNA 호모이머 결합은 520 nm에서 흥분 후 635 nm에서 방출되는 적색 형광을 유발합니다. 빛이 없는 경우 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 485와 520nm에서 두 개의 여기 필터가 장착된 반전된 현미경으로 구성된 자동 플레이트 리더기의 형광을 읽고, 520 및 635nm에서 2개의 배출 필터, 목표(x10), 프로세서가 제어하는 전동 스테이지 및 충전 결합 장치 카메라(CCD)를 참조하십시오. 이 카운팅 플랫폼은 변형소프트웨어(19)에의해 제어됩니다. 그것은 잘 A12쪽으로 우물 A1에서 시작하여 96 웰 플레이트의 각 우물에서 동시에 살아있는 세포와 죽은 세포의 형광 심을 획득 할 수 있게하고, B1을 향해 B12, C12등을 향한 C1등(표 I). 음의 대조군(표 I)의 18개의 웰을 사용하여 단일 셀의 평균 면적A를계산합니다. 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 계산하고 그 세포 이중 (2개의 세포의 그룹화)이 계산되는 것을 방지하기 위하여 다음 경험적 공식 A x 29/20.7을 적용합니다. 분자별 콘의 보호 효과를 분자별 보호 효과로 점수는 우리가 음의 대조군의 18 개의 우물에서 평균 세포 수 대 분자를 테스트 한 4 우물에서 평균 세포 수 사이의 비율로 (표 1 및 보충 도 1참조). 1 x 105 세포/cm2에서 시드된 플레이트의 결과를 2 x 105 세포/cm2에 시드하여 각 분자에 의한 잠재적 보호(생존율)를 평가한다.

Representative Results

우리는 원뿔이 풍부한 배양 시스템이 단백질을 보호하는 새로운 원뿔을 식별하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다. 우리는 8 주 오래 된 8 주 오래 된 에반스쥐43의400 눈에서 choroid 및 망막 색소 상피로 만든 정규화된 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다. 이 라이브러리는 6.0 x 106 독립적인 콜로니 형성 유닛(CfU)을 포함하고 있으며 재조합 클론의 99% 이상을 가진 평균 복제 인서트 크기는 2.1킬로베이스(kb)입니다. 해당 라이브러리에서 100클론의 풀은 COS-1 세포로 과도 하게 과도하게 전환(plasmid DNA의 0.1 μg)를 감염시켰으며, COS-1의 조건부 배지(CM)는 혈청 없이 DMEM에서 48시간 동안 인큐베이션 후 수확하였다. 멤브레인 또는 엑소솜은 초원심분리에 의해 제거되지 않았다. 각 CM의 50 마이크로리터는 2개의 96웰 플레이트의 4개의 우물에 추가되었습니다: 한 개는 2 x 105 세포/cm2에서시드되고, 다른 하나는 4 x 105 세포/cm2에서시드하였다. 라이브러리를 구성하는 데 사용되는 빈 벡터 pcDNA3.1로 전염된 COS-1 세포로부터의 CM은 음의 대조군(표1)으로사용되었다. 총 2,112세트의 100개의 클론이 4개의 배양 우물과 콘 농축 문화의 2개의 종자 조건에 대해 평가하였다. 이 두 가지 조건은 총 1,689,600개의 배양 우물에 대해 보호 활동을 보다 정확하게 평가할 수 있게 하는 두 개의 약간 다른 접종 밀도에 해당합니다. 2보다 큰 비율로 클론 42풀 중, 풀 0080 및 0073은 음의 대조군보다 7일 동안 배양 후 생존율이 16배, 14배 더 높다, pcDNA3.1(보충도1). 이 분석은 관심 있는 풀을 식별하는 데 필수적입니다. 각각 100클론의 각 선택된 풀은 글리세롤 스톡에서 10클론16세트로 세분화되었다. 이러한 하위 풀은 2차 심사(즉, 총 3,200개의 문화 우물)에서 동일한 방법에 따라 제조 및 테스트되었다. 서브 풀 0073-09는 가장 강한생존율(보충도 2A)을부여하고, 원뿔이 풍부한 문화에 대한 3차 심사에서 테스트된 16개의 개별 클론을 생산하도록 세분화되었다. 클론 0073-09-37 클론은 2.5(보조도 2B)와동일한 생존율로 다른 클론과 명확하게 두드러집니다. y축은 종자 밀도가 보충도 도 2A와 동일하더라도 다른 축을 갖는다. 우리는 몇 달 동안 매주 반복되는 것을 일반적으로 보았습니다. 분석 후, 이러한 결과는 클론 0073-09-37이 원뿔 생존에 강력하고 재현 가능한 영향을 미친다는 것을 확인한다. 시험은 독립적으로 반복되었다(도3A),1.8 kb의 삽입이 시퀀스되었다(도3B). 생물학적 분석 결과 클론 0073-09-37, 상피 유래 콘 생존성 인자(EdCVF)라고 명명한 이 프레임에는 3개의 오픈 판독 프레임(ORF)이 포함되어 있으며, 이는 쥐 단백질 아연 손가락 단백질-180(ZFP180, NP_653358)의 C 단말 부분의 84잔류(ORF1)에 대한 인코딩(ORFs)인코딩(ORFs) 44. 다른 두 ORFs (ORF2 및 ORF3)는 쥐에서 훨씬 덜 잘 보존되고 다른 포유동물에 결석합니다. 독립적으로 테스트할 때 ORF1만이콘(보충도 3)에보호 효과를 발휘합니다. ORF1은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 융합단백질(도 4A)으로제조되었다. EdCVF 단백질은 정제되었고 GST 태그가제거되었다(도 4B). EdCVF는 원뿔농축 배양시스템(도 4C)에서원뿔 변성을 방지할 수 있다. 그림 1: 개발의 28th,29th 및 30단계에서 닭 배아. 화살표 W : 날개, C : 칼라와 B : 법안. 배율 막대 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 닭 배아의 망막의 해부는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 상피 유래 콘 생존가능성 계수(EdCVF), 클론 0073-09-37. A. 원뿔이 풍부한 문화의 생존 력 향상. B. cDNA 클론 0073-09-37의 서열. 밑줄이 있는 시퀀스 GAATTC는 라이브러리를 구성하는 데 사용되는 EcoRI 제한 사이트입니다. 굵게 표시된 두 개의 코돈 GTG는 벡터에서 유래한 EdCVF에 대한 드문 번역 개시 사이트입니다. 학생 시험에 의한 통계 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 재조합 EdCVF 활성. 글루타티온 S-transferase(GST)와의 융합에서 EdCVF의 시퀀스. B. 정제 된 재조합 EdCVF 단백질. C. 문화원뿔에 대한 GST-EdCVF의 트로피크 활동. Tukey의 테스트를 이용한 통계 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보조 도 1: cDNA 풀 및 음극제에 대한 평균 세포 수의 비율, 1차 스크리닝 중 빈 벡터 pcDNA3.1로 감염된 COS-1 세포의 조건된 배지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.  보충 그림 2: 살아있는 셀 수입니다. A. 0073 풀의 하위 풀과 심사의 두 번째 라운드. B. 고립 된 클론과 검사의 세 번째 라운드. CN: 빈 벡터, pcDNA3.1로 감염된 COS-1 세포의 조건된 배지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 3: 격리 된 클론 0073-09-37의 세 개의 개방 판독 프레임의 트로피크 활성. 던넷의 테스트를 이용한 통계 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1 1 1 1 2 노스캐롤라이나 2 2 2 3 3 노스캐롤라이나 B 노스캐롤라이나 3 3 4 4 4 노스캐롤라이나 4 5 5 5 5 C 6 노스캐롤라이나 6 6 6 7 7 노스캐롤라이나 7 7 8 8 D 8 8 노스캐롤라이나 9 9 9 9 10 노스캐롤라이나 10 10 10 E 11 11 11 노스캐롤라이나 11 12 12 12 12 노스캐롤라이나 13 13 F 13 13 14 14 노스캐롤라이나 14 14 15 15 15 노스캐롤라이나 15 G 16 16 16 16 17 노스캐롤라이나 17 17 17 18 18 노스캐롤라이나 H 18 18 19 19 19 19 노스캐롤라이나 20 20 20 노스캐롤라이나 20 NC 네거티브 컨트롤 4배로 테스트된 풀의 1-20포지션 표 1: 높은 콘텐츠 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 계획

Discussion

닭 배아에서 원뿔 농축 문화의 생산을 제한 할 수있는 많은 매개 변수 중, 첫 번째 중요한 단계는 정확하게 부화 계란에서 배아의 개발 단계를 식별하는 것입니다. ED8(34단계)에서 배아망막으로부터 세포의 배양만 35%의 광수용체를 생산하고 나머지 65%는 다른 뉴런^4로이루어진 것으로 관찰되었다. 부화 된 계란을 얻기 위해 적용 된 물류가 무엇이든, 온도와 잠복기 시간을 미세 조정하고, 개발의 모든 단계의 참조 사진과 비교하여 신중하게 배아를 검사 할 필요가있다^42,45.

원래, 원뿔 농축 배양 시스템은 화이트 레그혼 균주^4를사용하여 개발되었다. 그 긴장의 계란의 백색은 프랑스에서 특히 평가되지 않습니다, 그래서 우리는 갈색 계란을 생산하는 닭의 변형을 사용했다. 우리는 JA57 암탉 5와 I 66 수탉을 건너 만든 I 657 변형을^{활용했다.} 우리는 원래 문화의 특성을 재현 할 수 있었다. 이것은 닭의 유전 배경이 원뿔 농축 문화를 얻기 위하여 중요하지 않다는 것을 보여줍니다.

우리는 배양 배지에서 보충제의 개별 제거의 효과를 테스트하지 않은, 하지만 인슐린rd1 마우스에서 원추의 생존에 인슐린의 효과에 따라 중요한 역할을 관찰, 자가 열RP^46의모델. 트리오도티로닌(T3)은 또한 개발 중 망막 세포 운명에서 갑상선 호르몬 수용체의 역할에 따라 닭 배아의 망막 전구체 세포의 분화에 참여할 수^있다(40) 따라서, 원뿔농축 배양 시스템은 발현^{복제(46)에}의해 인슐린을 식별하는 데 사용될 수 없다.

원뿔농축 배양 시스템은 1차 뉴런의 배양에 의존하고 세포주661W^{24,25,26으로}불멸세포의 사용에 의존하는 훨씬 더 적절한 타 방법이다.

여기에 기재된 방법은 플라스미드^DNA(20)로사전 전기포공을 수행함으로써 수정될 수 있다. 망막 세포 현탁액을 준비하기 전에 전체 망막은 10m Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA에서 플라스미드 DNA의 0.5 μg/μL의 120 μL을 가진 맞춤형 전기 포레이터의 챔버에 배치됩니다. 50 ms에 대해 15 V의 5 펄스는 각각 950 ms 간격^22로분리된다. 복제 유능한 조류 스플라이스(RCAS) 레트로바이러스를 콘 농축 배양으로 하여 간섭 RNA(RNAi)를 전달하는 시도는^{실패하였다 47.} 이것은 확실히 혈청의 부재와 저밀도의 배양에서, 망막 전구체 세포는 복제되지 않는다는 사실, 레트로 바이러스의 전파를위한 필수 조건 때문이다.

우리는 표현^{복제(19)를}사용하여 원뿔 생존을 촉진하는 트럭티크 인자를 식별하기 위해 원뿔농축 배양 시스템을 개발했다. 실현 가능하기 위해 100클론 풀에서 조건부 배지를 사용하여 높은 콘텐츠 스크리닝의 첫 번째 단계를 수행했습니다. 라이브러리로부터의 cDNA가 COS-1 세포의 이식 후 강력한 CMV 프로모터의 통제하에 발현되더라도, 개별 cDNA에 의해 인코딩된 모든 단백질이 생존 가능성 분석에 의해 양성으로 충분히 양수될 정도로 농도에 도달한다는 보증을 제공하지 않는다. 이것은 주요 제한사항입니다. 그런 의미에서, 어떤 검열든지 실제로 완전하지 않습니다. 또한, 조건부 배지에서 음골 단백질이 제거되지 않더라도, 분석의 구성은 비 확산 인자의 식별에 불리하다. 대안은 동일한 후보 단백질을 여러 번 속아 복제를 피하기 위해 cDNA의 서열을 얻은 후 개별 클론을 선별하는 것입니다. 이것은 우리가 사용하는 망막 cDNA 라이브러리를 시퀀싱하여 시작되었습니다⁴³. 합리적이지만, 이 접근 방식은 한계가 있습니다. cDNA 서열의 생물학적 분석은 중복성의 감소, 지식에 기초한 특정 클론 스크리닝의 우선 순위 외에 저항할 수 없이 부과할 것입니다. 마지막으로, 라이브러리를 수행하는 데 필요한 시간이 상당히 길어지더라도 전체 라이브러리가 심사될 경우 이것은 해롭지 않습니다. 그러나 변함없이, 시퀀스의 정체성은 결과를 보는 우리의 방법에 영향을 미칠 것입니다. 시퀀스의 해석이 자연스럽게 실험 데이터와 경쟁하기 때문에 이것은 중립적이지 않습니다.

EdCVF의 식별은 또한 높은 콘텐츠 스크리닝이 기술적 한계를 수반한다는 것을 보여줍니다. 1차 심사부터 활동이 많은 2개의풀(보충도 1)을확인했습니다. 풀 0073은 EdCVF의 성공적인 식별으로 이어졌고, 수영장 0080은 그러한 발견을 수행하지 않았습니다. 하위 풀을 준비하는 동안 활성 복제본이 손실되어 발생할 수 있는 문제를 해결하지 못했습니다. 대안적으로, 통계적으로 유리하지 않더라도, 풀 0080의 cDNA 중, 2개의 단백질이 시너지 효과적으로 작용하고 그들의 활동은 개별 클론으로 관찰될 수 없었다는 것을 배제되지 않는다.

작은 분자를 검열하여 콘을 보호하는 분자의 식별은 원뿔 농축 배양 시스템의 미래 응용입니다. 이러한 분자는 유전자 치료가 노화와 관련된 황반 변성으로 가장 적합한 접근 방식이 아닌 망막 병리 치료의 치료에 매우 유용할 것입니다.

Materials

96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)	Corning	3603
Calcein AM	Thermo-Fisher scientific	C1430
CCD Camera	Photometrics	CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate)	Sigma-Aldrich	C0256
CO2 Independant	Thermo-Fisher scientific	18045-054
Curved forceps	Dutscher	005093
DMEM Media	Thermo-Fisher scientific	41966-029
DNAse	Sigma-Aldrich	D4263
Eggs incubator	FarmLine	M08 01 3100
Ethidium Homodimer	Thermo-Fisher scientific	E1169
Fœtal bovine serum	Thermo-Fisher scientific	10270-098
Gentamycin	Thermo-Fisher scientific	15710-049
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0880
ITS (insulin Transferine selenium)	Sigma-Aldrich	I1884
large straight pliers	Dutscher	005074
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L8384
M199 medium	Thermo-Fisher scientific	31150-022
Metamorph software	Metamorph
Microscope	NIKON	Eclipse TE2000
Motorized stage	Martzauzer	Mutlicontrol 2000
Optical filter switch	Shutter Instrument company	Lambda 10-2
PBS 1X	Thermo-Fisher scientific	14190-086
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P6282
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Pursept A express	Fisher scientific	11814110
Putriscine	Sigma-Aldrich	P5780
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
straight forceps	Dutscher	005092
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan blue	Thermo-Fisher scientific	15250-061
Trypsine 0.25 %	Thermo-Fisher scientific	25200-056