Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Summary

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Abstract

Metabolômica é uma metodologia utilizada para a identificação e quantificação de muitos intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo dentro de uma célula, tecido, órgão, fluido biológico ou organismo. A metabolômica tradicionalmente se concentra em metabólitos solúveis em água. O metabolome solúvel em água é o produto final de uma complexa rede celular que integra vários fatores genômicos, epigenômicos, transcriômicos, proteômicos e ambientais. Assim, a análise metabolômica avalia diretamente o resultado da ação para todos esses fatores em uma infinidade de processos biológicos dentro de diversos organismos. Um desses organismos é o fermento saccharomyces cerevisiae, um eucariote unicelular com o genoma totalmente sequenciado. Como a S. cerevisiae é favorável a análises moleculares abrangentes, é usada como modelo para dissecar mecanismos subjacentes a muitos processos biológicos dentro da célula eucariótica. Um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa do metabolome solúvel em água forneceria a metodologia essencial para dissecar esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo para as condições otimizadas de atividade metabólica saciando e extração metabólito solúvel em água a partir de células de S. cerevisiae. O protocolo também descreve o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos metabólitos solúveis em água extraídos. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada descrito aqui é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de mais de 370 metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas, incluindo diferentes isômeros estruturais e formas estereogômicas desses metabólitos. Estes metabólitos incluem várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada é sensível e permite a identificação e a quantitação de alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL. O método tem sido usado com sucesso para avaliar metabóboles solúveis em água de células de levedura silvestre e mutantes cultivadas em diferentes condições.

Introduction

Metabólitos solúveis em água são intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo que contribuem para processos celulares essenciais. Esses processos evolutivamente conservados incluem a conversão de nutrientes em energia utilizável, síntese de macromoléculas, crescimento e sinalização celular, controle do ciclo celular, regulação da expressão genética, resposta ao estresse, regulação pós-translacional do metabolismo, manutenção da funcionalidade mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envelhecimento celular e morte celular regulada^1,2,3.

Muitos desses papéis essenciais de metabólitos solúveis em água foram descobertos por estudos na levedura S. cerevisiae^1,3^{,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Este eucariote unicelular é um organismo modelo útil para dissecar mecanismos através dos quais metabólitos solúveis em água contribuem para processos celulares devido à sua comodidade às análises biológicas bioquímicas avançadas, genéticas e moleculares^23,24,25,26. Embora os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada tenham sido utilizados para estudar os papéis de metabólitos solúveis em água em^{leveduras brotantes 3,18,22,27}, este tipo de análise requer a melhoria de sua versatilidade, robustez, sensibilidade e capacidade de distinguir entre diferentes isômeros estruturais e formas estereotipadas desses metabólicos.

Os últimos anos são marcados por avanços significativos na aplicação dos métodos LC-MS/MS de metabolômica não direcionada ao perfil de metabólitos solúveis em água in vivo. No entanto, muitos desafios no uso dessa metodologia permanecem^{2,28,29,30,31,32,33,34,35,36}. Esses desafios incluem o seguinte. Em primeiro lugar, as concentrações intracelulares de muitos metabólitos solúveis em água estão abaixo de um limiar de sensibilidade para os métodos atualmente utilizados. Em segundo lugar, a eficiência da saciamento da atividade metabólica é muito baixa, e a extensão do vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares é muito alta para os métodos atuais; portanto, os métodos atualmente utilizados subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, os métodos existentes não podem diferenciar os isômeros estruturais (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química, mas conectividade atômica diferente) ou estereomers (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química e conectividade atômica, mas com o arranjo atômico diferente no espaço) de metabólitos específicos; isso impede a anotação correta de certos metabólitos pelos métodos atualmente utilizados. Em quarto lugar, as bases de dados on-line espectrais existentes de íons-pais (MS1) e íons secundários (MS2) estão incompletas; isso afeta a identificação e a quantitação corretas de metabólitos específicos utilizando os dados brutos LC-MS/MS produzidos com a ajuda dos métodos atuais. Em quinto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo de extração metabólito para recuperar todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água. Em sexto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo da coluna LC para separar-se entre si todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água.

Aqui, otimizamos as condições para a extinção da atividade metabólica dentro das células de S. cerevisiae, mantendo a maioria dos metabólitos solúveis em água dentro dessas células antes da extração, e extraindo a maioria das classes de metabólitos solúveis em água de células de levedura. Desenvolvemos um método versátil, robusto e sensível para a identificação e quantificação baseada em LC-MS/MS de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células S. cerevisiae. Este método de metabolomia não-direcionada permite avaliar as concentrações intracelulares de várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método desenvolvido LC-MS/MS permite a identificação e quantificação de diferentes isômeros estruturais e formas estereosméricas de metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas.

Protocol

1. Fazer e esterilizar um meio para o cultivo de leveduras Faça 180 mL de um extrato completo de levedura com meio bactopepton (YP). O meio YP completo contém 1% (p/v) extrato de levedura e 2% (w/v) bactopeptone. Distribua 180 mL do meio YP igualmente em quatro frascos de 250 mL Erlenmeyer. Cada um desses frascos contém 45 mL do meio YP. Esterilize os frascos com meio YP autoclavando a 15 psi/121 °C por 45 min. 2. Cepa de levedura tipo selvagem <li…

Representative Results

Para melhorar uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura, otimizamos as condições de saciamento celular para detecção metabólito. A extinção celular para este fim envolve uma prisão rápida de todas as reações enzimáticas dentro de uma célula31,33,37,38. Tal apreensão da atividade metabólica ce…

Discussion

Para utilizar com sucesso o protocolo aqui descrito, siga as medidas preventivas descritas abaixo. Clorofórmio e metanol extraem várias substâncias de plásticos de laboratório. Portanto, lide com eles com cautela. Evite o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com qualquer um desses dois solventes orgânicos. Use pipetas de vidro borossilicato para estas etapas. Levante essas pipetas com clorofórmio e metanol antes de usar. Use apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a sol…

Materials

Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049