迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見
Summary
これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。
Abstract
最近のがん研究の進歩は、がん転移の非常に複雑な性質を示しています。複数の遺伝子または遺伝子ネットワークは、癌の種類、組織、および個々の患者の特性に依存する癌転移カスケード遺伝子および遺伝子産物を差し見なして調節することに関与していることが分かってきた。これらは、遺伝的治療と個別化された医療アプローチのための潜在的に重要なターゲットを表しています。これらの遺伝的標的の同定には、迅速なスクリーニングプラットフォームの開発が不可欠である。
ひよこ絨毛管内膜(CAM)は、発達中の胚のガス交換を可能にする卵殻の下に位置する高血管化されたコラーゲンリッチ膜である。CAMの位置と血管化により、コラーゲン豊富なマトリックスと血管系との癌細胞相互作用の堅牢なヒト癌細胞異種移植およびリアルタイムイメージングを可能にする生体内ヒト癌転移モデルとして開発しました。
このモデルを用いて、癌転移の新しいドライバーまたはサプレッサーの同定のために定量的スクリーニングプラットフォームを設計した。我々は、完全なヒトゲノムshRNA遺伝子ライブラリーを有する頭頸部HEp3癌細胞のプールをトランスニューシーにし、その後、低密度で細胞をCAM血管系に注入した。細胞は増殖し、単一腫瘍細胞コロニーを形成した。CAM組織に侵入できなかった個々のコロニーは、コンパクトコロニー表現型として見え、細胞内に存在するトランスデューシングshRNAの同定のために切除された。個々のコロニーの画像は、その侵襲性について評価された。誤検出の割合を減らすには、複数の選択を行いました。目的の遺伝子を発現する個々の、単離された癌細胞クローンまたは新たに設計されたクローンは、原発性腫瘍形成アッセイまたは癌細胞血管系共同選択肢分析を行った。要約すると、我々は、イベントの動的かつ複雑なカスケードの非転移性標的同定およびインビタル分析を可能にする迅速なスクリーニングプラットフォームを提示する。
Introduction
転移は、癌患者死亡の主な原因である1、2、3。転移性癌細胞は、転移性カスケードの5つのステップを通して、癌の種類に依存する明確なシグナル伝達経路を利用する:局所浸潤、内空内、循環中の生存、外発性、および遠くの転移部位におけるコロニー拡張。この転移過程の現在の理解は、2つのボトルネックステップがあり、1つは原発性腫瘍からの癌細胞の指向性浸潤であり、第2は遠隔部位転移病変4、5、6の確立であることを示唆している。どちらのステップも、初期浸潤または遠隔転移性病変形成部位において、癌細胞がコラーゲンおよび脈管構造と積極的に相互作用することを要求する。したがって、転移性癌細胞は、細胞に付着し、コラーゲン線維を改造し、血管壁7に沿って方向に侵入することができる必要がある。がん細胞がこれらのステップを完了するのを阻止するために、転移防止治療標的を迅速に同定できるスクリーニングモデルが最も重要である。既存のin vitroスクリーニングモデルは、複雑な生きた組織環境を完全に模倣していません。マウス モデルはコストがかかり、時間がかかります。そのため、複雑な生体組織環境と標的の迅速な同定を提供する生体内スクリーニングプラットフォームが急務です。
過去10年の間に、鶏の胚は、ヒト癌転移8、9、10、11、12の堅牢で費用対効果の高いモデルとして確立された。このチック絨毛膜(CAM)組織は薄く半透明であり、原発性腫瘍および/または転移部位における細胞およびコロニー行動の生体内顕微鏡イメージングに理想的である。複数のヒト癌細胞株からの原発性腫瘍増殖は、CAM組織へのマイクロインジェクション後わずか数日のスパン内で開始および転移することができる。癌細胞は、静脈内、CAM内、またはコラーゲンオンプラントを含むいくつかの方法でCAM組織に投与することができ、この柔軟性は、研究者が癌進行の特定の段階、例えば転移性病変形成、原発性腫瘍または血管新生の侵入に焦点を当てることを可能にする。
ここでは、がん細胞が侵襲的転移性病変を確立する能力を測定するために使用できる定量的スクリーニングプラットフォームについて説明する。発現ライブラリーを用いて導入された癌細胞は、低密度でCAM血管系に静脈内に静脈内注入される。転移性コロニーは4〜5日間形成され、その後、得られたコロニーの浸潤能力と脈管系相互作用が評価される。侵入に失敗した個々のコロニーは、コロニーのコンパクトさと癌細胞血管接触の再注入および定量化によってCAMにおいて切除され、伝播され、その表現型が確認される。単一転移性コロニー変異型を担う発現ライブラリー構築物は、高スループットシーケンシングを介して単離コロニーゲノムDNAから同定される。同じプラットフォームは、遺伝子と観察された表現型との因果関係を検証したり、観察された表現型に関する詳細な機械学的研究を行うためにさらに使用され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、遺伝または薬剤候補スクリーンなどの重要なアプリケーションに利用できる迅速な蛍光顕微鏡ベースの生体内スクリーニングプロトコルについて説明する。目的の遺伝的ライブラリーを用いて形質転換された癌細胞、または個々の発現構築物にトランスフェクトされた癌細胞は、このひよこCAMモデルを用いて目的の表現型に関して迅速にスクリーニングおよび定量することができ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、JDLとKSに#702849カナダ癌学会研究所グラントによって支援されました。ルイス博士は、アルバータがん財団が支援する前立腺癌研究のフランクとカーラ・ソジョンキー・チェアを務めています。
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
Referencias
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