Трех- и четырехмерные подходы визуализации и анализа для изучения осевого удлинения и сегментации позвоночных
Summary
Здесь описаны вычислительные инструменты и методы, позволяющие визуализировать и анализировать трех- и четырехмерные данные изображения эмбрионов мышей в контексте осевого удлинения и сегментации, полученные методом оптической проекционной томографии, а также путем живой визуализации и полноразмерного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием многофотонной микроскопии.
Abstract
Сомитогенез является отличительной чертой эмбрионального развития позвоночных. В течение многих лет исследователи изучали этот процесс в различных организмах, используя широкий спектр методов, охватывающих подходы ex vivo и in vitro. Тем не менее, большинство исследований по-прежнему полагаются на анализ данных двумерной (2D) визуализации, что ограничивает надлежащую оценку процесса развития, такого как осевое расширение и сомитогенез, включающий высокодинамические взаимодействия в сложном 3D-пространстве. Здесь мы описываем методы, которые позволяют мышам получать изображения в реальном времени, обрабатывать наборы данных, визуализировать и анализировать в 3D и 4D для изучения клеток (например, нейромезодермальных предшественников), участвующих в этих процессах развития. Мы также предоставляем пошаговый протокол для оптической проекционной томографии и полноразмерной иммунофлуоресцентной микроскопии у эмбрионов мышей (от подготовки образцов до получения изображений) и показываем конвейер, который мы разработали для обработки и визуализации данных 3D-изображений. Мы расширяем использование некоторых из этих методов и выделяем специфические особенности различного доступного программного обеспечения (например, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira и Imaris), которые могут быть использованы для улучшения нашего текущего понимания осевого расширения и формирования сомита (например, 3D-реконструкции). В целом, описанные здесь методы подчеркивают важность визуализации и анализа 3D-данных в биологии развития и могут помочь другим исследователям лучше рассматривать данные 3D и 4D изображений в контексте осевого расширения и сегментации позвоночных. Наконец, в работе также используются новые инструменты для облегчения обучения эмбриональному развитию позвоночных.
Introduction
Формирование оси тела позвоночных является очень сложным и динамичным процессом, происходящим во время эмбрионального развития. В конце гаструляции [у мыши, около эмбрионального дня (E) 8,0], группа клеток-предшественников эпибластов, известных как нейромезодермальные предшественники (NMP), становится ключевым фактором осевого расширения в последовательности голова-хвост, генерируя нервную трубку и параксиальные мезодермальные ткани во время формирования шеи, туловища и хвоста 1,2,3,4 . Интересно, что положение, которое эти НМП занимают в каудальном эпибласте, по-видимому, играет ключевую роль в принятии решения о дифференциации в мезодерму или нейроэктодерму5. Хотя в настоящее время у нас нет точного молекулярного отпечатка для NMP, эти клетки, как правило, считаются коэкспрессирующими T (Brachyury) и Sox2 5,6. Точные механизмы, регулирующие судьбоносные решения NMP (т. Е. Принимают ли они нейронные или мезодермальные пути), только начинают точно определяться. Экспрессия Tbx6 в области примитивной полосы является ранним маркером решения судьбы NMP, так как этот ген участвует в индукции и спецификации мезодермы 6,7. Интересно, что ранние клетки мезодермы, по-видимому, экспрессируют высокие уровни Epha18 и передачи сигналов Wnt / β-катенина, а также Msgn1 также играют важную роль в дифференцировке параксиальной мезодермы и образовании сомита 9,10. Полный пространственно-временной анализ НМП на уровне одной клетки, безусловно, будет способствовать полному пониманию молекулярных механизмов, контролирующих спецификацию мезодермы.
Образование сомитов (предшественников позвонков) является ключевой особенностью позвоночных. Во время осевого удлинения параксиальная мезодерма сегментируется в ряд двусторонних повторяющихся единиц, известных как сомиты. Количество сомитов и время, необходимое для формирования новых сегментов, варьируется у видов11,12. Сомитогенез включает периодические сигнальные колебания (известные как «часы сегментации»), которые могут наблюдаться циклической экспрессией нескольких генов сигнальных путей Notch, Wnt и Fgf в пресомитической мезодерме (например, Lfng)11,12. Современная модель сомитогенеза также постулирует существование «волнового фронта созревания», серии сложных сигнальных градиентов, включающих передачу сигналов Fgf, Wnt и ретиноевой кислоты, которые определяют положение задней границы каждого нового сомита. Поэтому скоординированное взаимодействие между «часами сегментации» и «волновым фронтом созревания» имеет основополагающее значение для генерации этих модулей-предшественников позвонков, поскольку возмущения в этих ключевых морфогенетических процессах могут привести к эмбриональной летальности или к образованию врожденных пороков развития (например, сколиоза)13,14,15.
Несмотря на значительные последние достижения в области методов визуализации, методов анализа биоизображений и программного обеспечения, большинство исследований осевого удлинения и сомитогенеза по-прежнему опираются на одиночные/изолированные двумерные данные изображения (например, срезы), что не позволяет провести полную многомерную визуализацию тканей и затрудняет четкую дифференциацию между патологическими пороками развития (т.е. из-за мутаций) и нормальными морфологическими вариациями, происходящими во время эмбрионального развития16 . Визуализация в 3D уже обнаружила новые морфогенетические движения, ранее не идентифицированные стандартными 2D-методами 17,18,19,20, подчеркивая силу визуализации in toto для понимания механизмов сомитогенеза позвоночных и осевого расширения.
3D- и 4D-микроскопия эмбрионов мышей, особенно живая визуализация, технически сложна и требует критических шагов во время подготовки образцов, сбора изображений и предварительной обработки данных, чтобы обеспечить точный и значимый пространственно-временной анализ. Здесь мы описываем подробный протокол для живой визуализации и иммунофлуоресцентного окрашивания эмбрионов мышей, который может быть использован для изучения как NMP, так и мезодермальных клеток во время осевого расширения и сегментации. Кроме того, мы также описываем протокол оптической проекционной томографии (ОПТ) старых эмбрионов и плодов, который позволяет 3D в тото визуализации и количественной оценке патологических аномалий, которые могут возникнуть в результате проблем во время сомитогенеза (например, сращения костей и сколиоза)13,21,22. Наконец, мы иллюстрируем силу реконструкций 3D-визуализации в изучении и обучении сегментации позвоночных и осевого удлинения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Осевое удлинение и сегментация являются двумя наиболее сложными и динамичными процессами, происходящими во время эмбрионального развития позвоночных. Использование 3D- и 4D-визуализации с одноклеточным отслеживанием применялось в течение некоторого времени для изучения этих процессо…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Оливье Пуркие и Александра Аулехлу за штамм репортера LuVeLu, лабораторию SunJin за тестовый образец RapiClear, Уго Перейру за помощь с использованием BigStitcher, Нуну Гранжейру за помощь в настройке аппарата визуализации в реальном времени, объект для животных IGC и бывших и нынешних членов лаборатории Mallo за полезные комментарии и поддержку в ходе этой работы.
Мы благодарим за техническую поддержку Центра расширенной визуализации МКГР, который поддерживается португальским финансированием ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 и ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, совместно финансируемым Региональной оперативной программой Лиссабона (Lisboa 2020) в соответствии с Соглашением о партнерстве с Португалией 2020 года, через Европейский фонд регионального развития (FEDER) и Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Португалия). Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Португалия) и SCML-MC-60-2014 (Санта-Каса-да-Мизерикордия, Португалия) M.M., исследовательской инфраструктурой Congento, проектом LISBOA-01-0145-FEDER-022170 и стипендией PhD PD/BD/128426/2017 для A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
Referencias
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Biología del desarrollo. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
