Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Summary

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Abstract

Este protocolo descreve um método para obter frações proteicas subcelulares de células de mamíferos usando uma combinação de detergentes, lise mecânica e centrifugação de gradiente de densidade isopícnica. A principal vantagem deste procedimento é que ele não depende do uso exclusivo de detergentes solubilizantes para obter frações subcelulares. Isso torna possível separar a membrana plasmática de outras organelas ligadas à membrana da célula. Este procedimento facilitará a determinação da localização de proteínas em células com um método reprodutível, escalável e seletivo. Este método tem sido usado com sucesso para isolar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriais e da membrana plasmática da linhagem celular de monócitos humanos, U937. Embora otimizado para esta linhagem celular, este procedimento pode servir como um ponto de partida adequado para o fracionamento subcelular de outras linhagens celulares. Possíveis armadilhas do procedimento e como evitá-las são discutidas, assim como alterações que podem precisar ser consideradas para outras linhagens celulares.

Introduction

O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente^1,2, contando com o uso de tampões contendo quantidades crescentes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Embora este método seja rápido e conveniente, resulta em frações impuras. Estes são projetados para permitir que os pesquisadores isolem facilmente um ou dois componentes da célula, mas não são complexos o suficiente para isolar múltiplas frações subcelulares de uma amostra ao mesmo tempo. Depender apenas de detergentes geralmente resulta em organelas fechadas por membrana e a membrana plasmática sendo indiscriminadamente solubilizada, dificultando a separação desses componentes. Uma complicação adicional do uso desses kits é a incapacidade dos pesquisadores de alterá-los / otimizá-los para aplicações específicas, já que a maioria dos componentes são formulações proprietárias. Finalmente, esses kits podem ser proibitivamente caros, com limitações no número de usos que os tornam menos do que ideais para amostras maiores.

Apesar da disponibilidade de kits para o isolamento de mitocôndrias que não dependem de detergentes, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e produzir quantidades significativamente menores de amostra do que os protocolos de isolamento padrão ^3,4. Embora os métodos de centrifugação diferenciais sejam mais demorados, eles geralmente resultam em frações distintas que não podem ser obtidas com kits exclusivamente à base de detergente¹. A separação sem o uso exclusivo de detergentes solubilizantes também permite uma purificação adicional usando ultracentrifugação e gradientes de densidade isopícnica, resultando em menos contaminação cruzada. Este protocolo de fracionamento demonstra o isolamento de frações subcelulares dos monócitos U937 usando uma combinação de abordagens baseadas em detergente e centrífuga de alta velocidade. Este método facilitará o isolamento dos componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriais e da membrana plasmática de uma célula de mamíferos com contaminação mínima entre as frações.

Protocol

1. Prepare tampões e reagentes Prepare soluções frescas de fosfatase e inibidores da protease.Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM.NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear o PMSF, pois é perigoso quando ingerido ou inalado e em contato com a pele ou os olhos. É corrosivo para os olhos e pele. De acordo com as instruções do fabricante, prepare um coquetel inibidor de protease comercialmente disp…

Representative Results

Um fluxograma esquemático deste procedimento (Figura 1) resume visualmente as etapas que foram tomadas para fracionar com sucesso as células U9375 cultivadas em suspensão. As frações coletadas do topo do gradiente de densidade isopícnico em volumes iguais (1 mL) mostram a purificação das frações mitocondrial e de membrana (Figura 2). A utilização de um anticorpo contra VDAC, uma proteína localizada na membrana mitocondrial ex…

Discussion

Este método é uma versão modificada de uma abordagem previamente publicada para o fracionamento subcelular sem o uso de centrifugação de alta velocidade¹¹. Este método modificado requer equipamentos mais especializados para alcançar os melhores resultados, mas é mais abrangente e consistentemente reprodutível.

O desenvolvimento do protocolo inicial foi necessário devido à incapacidade de separar amostras mitocondriais e de membrana para a análise da localiza…

Materials

Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661