3D-визуализация коллагеновых волокон PDL во время ортодонтического движения зубов в модели нижнечелюстной мыши
Summary
Представлен протокол генерации ортодонтического движения зубов у мышей и методы 3D визуализации коллагеновых волокон и кровеносных сосудов пародонтальной связки без сечения.
Abstract
Ортодонтическое движение зубов представляет собой сложный биологический процесс изменения ремоделирования мягких и твердых тканей в результате внешних сил. Чтобы понять эти сложные процессы ремоделирования, крайне важно изучить ткани зуба и пародонта в их 3D-контексте и, следовательно, свести к минимуму любые сечения и тканевые артефакты. Мышиные модели часто используются в биологии развития и структурной биологии, а также в биомеханике из-за их небольшого размера, высокой скорости метаболизма, генетики и простоты обращения. В принципе, это также делает их отличными моделями для стоматологических исследований. Однако основным препятствием является их небольшой размер зубов, в частности моляров. Данная работа направлена на предоставление пошагового протокола генерации ортодонтического движения зуба и двух методов 3D-визуализации фиброзного компонента пародонтальной связки мышиного моляра нижней части. Первый представленный метод основан на микро-КТ-установке, позволяющей фазовую визуализацию свежих коллагеновых тканей. Второй метод представляет собой метод очистки кости с использованием этилциннамата, который позволяет визуализировать кость без сечения и сохраняет эндогенную флуоресценцию. Сочетание этого метода очистки с репортерными мышами, такими как Flk1–Cre; TdTomato предоставил первую в своем роде возможность изобизировать 3D-сосудистую в PDL и альвеолярной кости.
Introduction
Основным биологическим процессом в ортодонтическом движении зубов (OTM) является ремоделирование кости. Триггер для этого процесса ремоделирования приписывается изменениям в структуре пародонтальной связки (PDL), таким как напряжение внеклеточного матрикса (ECM), некроз, а также разрушение кровеносных сосудов и образование1,2,3. Другие возможные триггеры для ремоделирования альвеолярной кости связаны с зондированием силы остеоцитами в кости, а также механической деформацией самой альвеолярной кости; однако их роль в ОТМ до сих пор до конца не выяснена4,5.
Несмотря на множество исследований, направленных на выявление структурно-функциональных отношений PDL при OTM, четкий функциональный механизм еще предстоит определить6,7. Основной причиной этого является проблема с получением данных о мягких тканях (PDL), расположенных между двумя твердыми тканями (цементом и альвеолярной костью). Принятые методы сбора структурной информации обычно требуют фиксации и секционирования, которые нарушают и изменяют структуру PDL. Более того, большинство из этих методов дают 2D-данные, которые даже если и не искажены, дают лишь частичную и локализованную информацию. Поскольку PDL не является однородным по своей структуре и функциям, оправдан подход, который обращается к неповрежденной 3D-структуре всего комплекса зуб-PDL-кость.
В этой статье будет описан метод генерации OTM у мышей и два метода, которые позволяют 3D-визуализацию коллагеновых волокон в PDL без какого-либо сечения образца.
Мышиные модели широко используются для экспериментов in vivo в медицине, биологии развития, доставке лекарств и структурных исследованиях. Они могут быть генетически модифицированы для устранения или усиления специфических белков и функций; они обеспечивают быстрый, воспроизводимый и предсказуемый контроль развития; они также легко изобразимы из-за их небольшого размера8. Несмотря на свои многочисленные преимущества, мышиные модели в стоматологических исследованиях используются не часто, особенно когда клинические манипуляции оправданы, в основном из-за небольших размеров зубов. Животныемодели,такие как крысы9,10,11,собаки12,13,свиньи14,15,16 и обезьяны17, используются чаще, чем мыши. С недавним развитием методов визуализации с высоким разрешением преимущества использования мышиной модели для расшифровки запутанных процессов в OTM многочисленны. В данной работе представлен метод генерации мезиального движения молярного зуба в мандибле с постоянными силовыми уровнями, которые вызывают ремоделирование кости. Большинство экспериментов OTM на грызунах проводятся в верхней челюсти, так как подвижность мандиблы и наличие языка добавляют еще один уровень сложности. Тем не менее, мандибля имеет много преимуществ, когда желательна 3D-структурная целостность. Его можно легко рассекать как целую кость; у некоторых видов он может быть разделен на две геми-мандиблы через волокнистый симфиз; он компактный, плоский и содержит только зубы без каких-либо синусовых пространств. Напротив, верхняя челюсть является частью черепа и тесно связана с другими органами и структурами, поэтому необходимо обширное сечение, чтобы рассекать альвеолярную кость с ассоциированными зубами.
Используя камеру влажности в доме, соединенную с системой загрузки внутри микро-КТ высокого разрешения, которая позволяет фазовое усиление, мы разработали метод визуализации свежих волокнистых тканей в 3D, как описаноранее 9,18,19,20,21,22,23. Свежие ткани сканируются сразу после жертвоприношения животного без какого-либо окрашивания или фиксации, что уменьшает тканевые артефакты, а также изменения биомеханических свойств. Эти 3D-данные могут быть использованы для распределения и анализа направления волокон, как описано в другом месте19.
Второй 3D-метод визуализации целых тканей, представленный здесь, основан на оптической очистке мандиблы, которая позволяет визуализировать волокна PDL через кость без какого-либо сечения. Интересно, что он также позволяет визуализировать коллагеновые волокна самой кости, однако это не будет обсуждаться здесь. В целом, существует два метода очистки тканей. Первый представляет собой очистку на водной основе, когда образец погружается в водный раствор с показателем преломления более 1,4 либо путем простого погружения, гипергидратации или встраивания гидрогеля. Однако этот метод ограничен в уровне прозрачности, а также структурной сохранности ткани и поэтому требует фиксации ткани. Вторым способом, который дает высокопрозрачные образцы и не требует фиксации, является метод очистки на основе растворителей24,25. Мы создали модифицированный метод очистки на основе растворителей на основе этил-3-фенилпропа-2-еноата (этилциннамат, ECi) для образцов нижней и нижней впальца. Этот метод имеет преимущества использования нетоксичного пищевого очищающего агента, минимального усадки тканей и сохранения флуоресцентных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генерация OTM у мышей очень желательна из-за размера, генетики и преимуществ обработки. Использование мандиблы обеспечивает простоту обращения как с точки зрения рассечения тканей, так и с точки зрения подготовки образцов и визуализации. Здесь мы представили метод генерации OTM с трансля…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано NIH (NIDCR R00- DE025053, PI: Naveh). Мы хотели бы поблагодарить Гарвардский центр биологической визуализации за инфраструктуру и поддержку. Все цифры генерируются с biorender.com.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
Referencias
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
