חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים
Summary
פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין. היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).
Abstract
עיבויים הקשורים לכרומטין מעורבים בתהליכים גרעיניים רבים, אך המנגנונים הבסיסיים נותרים חמקמקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים בטלומרים. הדימרייזר הכימי מורכב משני ליגנדים מקושרים שיכולים להיקשר כל אחד לחלבון: ליגנד Halo ל-Halo-enzyme וטימופרים (TMP) ל-E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR), בהתאמה. היתוך של אנזים Halo לחלבון טלומר מעגן דימריזרים לטלומרים באמצעות כריכת אנזים הילה ליגנד קוולנטית. כריכה של TMP ל- eDHFR מגייסת שלב מותך eDHFR המפריד חלבונים לטלומרים ודורשת היווצרות עיבוי. מכיוון שאינטראקציית TMP-eDHFR אינה קוולנטית, ניתן להפוך עיבוי באמצעות TMP חינם עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. דוגמה של גרימת היווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) בטלומרים וקביעת צמיחה עיבוי, פירוק, לוקליזציה והרכב מוצגת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות גנומיים אחרים על ידי היתוך Halo לחלבון שנקשר ישירות לכרומטין המקומי או dCas9 כי הוא ממוקד לוקוס גנומי עם RNA מדריך. על ידי הצעת הרזולוציה הזמנית הנדרשת להדמיה חיה של תא יחיד תוך שמירה על הפרדת פאזה באוכלוסיית תאים לבדיקות ביוכימיות, שיטה זו מתאימה לבדיקת היווצרות ותפקוד של עיבויים הקשורים לכרומטין.
Introduction
חלבונים וחומצות גרעין רבים עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) ומרכיבים את עצמם לתוך עיבויים ביומולקולריים כדי לארגן ביוכימיה בתאים1,2. LLPS של חלבונים מחייב כרומטין מוביל להיווצרות של עיבויים הקשורים loci גנומי ספציפי והם מעורבים פונקציות כרומטין מקומיות שונות3. לדוגמה, LLPS של חלבון HP1 עומד בבסיס היווצרות של תחומים הטרוכרומטינים כדי לארגן את הגנום4,5, LLPS של גורמי שעתוק יוצר מרכזי שעתוק כדי לווסת את שעתוק6, LLPS של mRNAs המתהווה וחלבון מסרקים מרובי מיניים מייצר גופי לוקוס histone כדי לווסת את שעתוק ועיבוד של histone mRNAs7. עם זאת, למרות דוגמאות רבות של עיבוי הקשורים כרומטין מתגלה, המנגנונים הבסיסיים של היווצרות עיבוי, רגולציה ותפקוד להישאר מובן היטב. בפרט, לא כל עיבוי הקשורים כרומטין נוצרים באמצעות LLPS והערכות זהירה של היווצרות עיבוי בתאים חיים עדיין נדרשים8,9. לדוגמה, חלבון HP1 בעכבר מוצג כבעל יכולת חלשה בלבד ליצור טיפות נוזליות בתאים חיים ומוקדי הטרוכרומטין מתנהגים כמו כדוריות פולימר שקרסו10. לכן, כלים כדי לגרום de novo עיבויים על כרומטין בתאים חיים רצויים, במיוחד אלה המאפשרים שימוש בהדמיה חיה וביקורת ביוכימית כדי לפקח על הקינטיקה של היווצרות עיבוי, התכונות הפיזיות והכימיות של העיבויים המתקבלים, ואת ההשלכות התאיות של היווצרות עיבוי.
פרוטוקול זה מדווח על מערכת עמעום כימית כדי לגרום לעיבוי חלבון בכרומטין11 (איור 1A). הדימרייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים: טרימתופרים (TMP) וליגנד Halo ויכול לעמעם חלבונים המותכים לקולטני הקוגניט: Escherichia coli dihydrofolate reductase (eDHFR) ואנזים אלקילדהלוגנאז חיידקי (אנזים Halo), בהתאמה12. האינטראקציה בין האנזים Halo ligand ואנזים Halo היא קוולנטית, ומאפשרת אנזים Halo לשמש עוגן על ידי היתוך אותו לחלבון מחייב כרומטין כדי לגייס חלבון הפרדת פאזה הותך eDHFR לכרומטין. לאחר הגיוס הראשוני, ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבון עובר את הריכוז הקריטי הדרוש להפרדת פאזה ובכך מגרגר עיבוי בעוגן (איור 1B). על ידי היתוך חלבונים פלואורסצנטיים (למשל mCherry ו- eGFP) ל- eDHFR והילה, ניתן לדמיין התגרענות וצמיחה של עיבויים בזמן אמת עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. מכיוון שהאינטראקציה בין eDHFR ל- TMP אינה קוולנטית, ניתן להוסיף TMP ללא עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. לאחר מכן זה ישחרר את חלבון הפרדת הפאזה מהעוגן ולהמיס את העיבוי הקשור לכרומטין.
השתמשנו בכלי זה כדי לגרום להיווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית דה נובו (PML) בטלומרים בתאי סרטן שליליים טלומראז המשתמשים בהארכה חלופית של מסלול הטלומרים (ALT) לתחזוקת הטלומר13,14. גופים גרעיניים PML הם תאים ללא ממברנה המעורבים בתהליכים גרעיניים רבים15,16 והם מקומיים באופן ייחודי טלומר ALT כדי ליצור APBs, עבור גופי PML הקשורים טלומר ALT17,18. אשכול טלומרים בתוך APBs, ככל הנראה כדי לספק תבניות תיקון עבור סינתזת DNA טלומר מונחה הומולוגיה ב ALT19. ואכן, סינתזת DNA טלומר זוהתה APBs ו APBs לשחק תפקידים חיוניים העשרת גורמי תיקון DNA בטלומרים20,21. עם זאת, המנגנונים שבביד הרכבת APB ואשכול הטלומר בתוך APBs לא היו ידועים. מאז חלבוני טלומר בתאי ALT משתנים באופן ייחודי על ידי מחליף קטן דמוי אוביקוויטין (SUMOs)22, רכיבי APB רבים מכילים אתרי סומוילציה 22,23,24,25 ו / או מוטיבים אינטראקציה SUMO (SIMs)26,27 ואינטראקציות SUMO-SIM כונן הפרדת שלב28, שיערנו כי סומוילציה על טלומרים מוביל להעשרה של SUMO / SIM המכיל חלבונים ו אינטראקציות SUMO-SIM בין חלבונים אלה מובילות להפרדת פאזה. חלבון PML, שיש לו שלושה אתרי סומוילציה ואתר SIM אחד, ניתן לגייס טלומרים סומויליים כדי ליצור APBs והתמזגות של APBs נוזלי מוביל להתקבצות טלומרים. כדי לבחון השערה זו, השתמשנו במערכת הדממה הכימית כדי לחקות היווצרות APB הנגרמת על ידי סומוילציה על ידי גיוס SIM לטלומרים (איור 2A)11. GFP מותך Haloenzyme להדמיה ולחלבון טלומר מחייב TRF1 כדי לעגן את הדמיר לטלומרים. ה-SIM מותך ל-eDHFR ול-mCherry. קינטיקה של היווצרות עיבוי ו clustersion טיפה המושרה טלומר קיבוץ הם אחריו עם הדמיה תא חי. הפרדת הפאזה הפוכה על-ידי הוספת TMP חינם עודף כדי להתחרות בכריכה של eDHFR. אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH) משמשים לקביעת הרכב עיבוי ואיגוד טלומרי. גיוס SIM מעשיר את SUMO בטלומרים והמרוכזים המושרים מכילים PML ולכן הם APBs. גיוס מוטציה SIM שאינה יכולה לקיים אינטראקציה עם SUMO אינה מעשירה את SUMO בטלומרים או גורמת להפרדת פאזה, מה שמצביע על כך שהכוח המניע הבסיסי ל עיבוי APB הוא אינטראקציית SUMO-SIM. מסכים עם תצפית זו, פוליסומו-פוליסים פולימרים שהתמזגו לגורם מחייב TRF2 RAP1 יכול גם לגרום להיווצרות APB29. בהשוואה למערכת ההיתוך polySUMO-polySIM שבה הפרדת פאזה מתרחשת כל עוד מיוצרים מספיק חלבונים, גישת הדמיזציה הכימית המוצגת כאן גורמת להפרדת פאזה על פי דרישה ובכך מציעה רזולוציה זמנית טובה יותר לניטור הקינטיקה של הפרדת פאזה ותהליך קיבוץ הטלומר. בנוסף, מערכת עמעום כימית זו מאפשרת גיוס חלבונים אחרים כדי להעריך את יכולתם בגרימת הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. לדוגמה, חלבון מופרע המגויס לטלומרים יכול גם ליצור טיפות וטלומרים מקבצי מבלי לגרום להיווצרות APB, דבר המצביע על קיבוץ טלומר שאינו תלוי בכימיה של APB ונשען רק על נכס נוזלי APB11.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הדגים היווצרות ופירוק של עיבויים בטלומרים עם מערכת עמעום כימית. קינטיקה של הפרדת פאזה ואשכול טלומר המושרה על ידי טיפה-היתוך מנוטרים באמצעות הדמיה חיה. לוקליזציה מרוכזת והרכב נקבעים עם דג DNA וחלבון IF.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא לקבוע חלבון ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב (1K22CA23763201 ל H.Z., GM118510 עד D.M.C.) וקרן צ’ארלס א. קאופמן ל- H.Z. המחברים רוצים להודות לג’ייסון טונס על הגהת כתב היד.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Referencias
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Investigación sobre el cáncer. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 – Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
