Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Summary

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Abstract

Plusieurs membres de la famille des protéines liées à la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP) conservées de manière évolutionnaire (ORP) / homologues OSBP (Osh) ont récemment été trouvés pour représenter un nouveau groupe de protéines de transfert lipidique (LTP) dans les levures et les cellules humaines. Ils transfèrent la phosphatidylsérine (PS) du réticulum endoplasmique (RE) à la membrane plasmique (PM) via les cycles d’échange PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P). Cette découverte permet de mieux comprendre comment la PS, qui est essentielle pour les processus de signalisation, est distribuée dans toute la cellule et d’enquêter sur le lien entre ce processus et le métabolisme du phosphoinositide (PIP). Le développement de nouveaux protocoles basés sur la fluorescence a joué un rôle déterminant dans la découverte et la caractérisation de ce nouveau mécanisme cellulaire in vitro au niveau moléculaire. Cet article décrit la production et l’utilisation de deux capteurs lipidiques marqués par fluorescence, NBD-C2_Lact et NBD-PH_FAPP,pour mesurer la capacité d’une protéine à extraire PS ou PI(4)P et à transférer ces lipides entre membranes artificielles. Tout d’abord, le protocole décrit comment produire, étiqueter et obtenir des échantillons de haute pureté de ces deux constructions. Deuxièmement, cet article explique comment utiliser ces capteurs avec un lecteur de microplaques de fluorescence pour déterminer si une protéine peut extraire PS ou PI(4)P des liposomes, en utilisant Osh6p comme étude de cas. Enfin, ce protocole montre comment mesurer avec précision la cinétique de l’échange PS/PI(4)P entre liposomes de composition lipidique définie et déterminer les taux de transfert lipidique par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) à l’aide d’un fluoromètre standard.

Introduction

La distribution précise des lipides entre différentes membranes et à l’intérieur des membranes des cellules eucaryotes^1,2 a de profondes implications biologiques. Décrypter le fonctionnement des LTP est une question importante en biologie cellulaire³,^4,5,6, et les approches in vitro sont d’une grande valeur pour aborder cette question^7,8,9,10,11. Ici, une stratégie in vitrobasée sur la fluorescence est présentée qui a joué un rôle déterminant dans l’établissement que plusieurs protéines ORP/Osh affectent l’échange PS/PI(4)P entre les membranes cellulaires¹² et constituent ainsi une nouvelle classe de LTP. PS est un glycérophospholipide anionique qui représente 2 à 10% des lipides membranaires totaux dans les cellules eucaryotes^13,14,16. Il est distribué le long d’un gradient entre l’ER et le PM, où il représente 5-7% et jusqu’à 30% des glycérophospholipides, respectivement^17,18,19. De plus, la PS est essentiellement concentrée dans la foliole cytosolique du PM. Cette accumulation et la partition inégale de PS dans le PM sont essentielles pour les processus de signalisation cellulaire¹⁹. En raison de la charge négative des molécules PS, la foliole cytosolique du PM est beaucoup plus anionique que la foliole cytosolique des autres organites^1,2,19,20. Cela permet le recrutement, via des forces électrostatiques, de protéines de signalisation telles que le substrat C-kinase riche en alanine myristylée (MARCKS)^21,le sarcome (Src)^22,l’oncogène viral du sarcome Kirsten-rat (K-Ras)²³et le substrat de toxine botulique C3 lié à Ras 1 (Rac1)²⁴ qui contiennent un tronçon d’acides aminés chargés positivement et une queue lipidique.

La PS est également reconnue par la protéine kinase C conventionnelle de manière stéréosélective via un domaine C2^25. Cependant, le PS est synthétisé dans^{l’ER 26}, indiquant qu’il doit être exporté vers le PM avant de pouvoir jouer son rôle. On ne savait pas comment cela avait été accompli¹⁹ jusqu’à ce que l’on constate que, dans la levure, Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM^27. Ces LTP appartiennent à une famille conservée de manière évolutionnaire chez les eucaryotes dont le membre fondateur est OSBP et qui contient des protéines (ORP chez l’homme, protéines Osh chez la levure) intégrant un domaine lié à l’OSBP (ORD) avec une poche pour héberger une molécule lipidique. Osh6p et Osh7p sont uniquement constitués d’un ORD dont les caractéristiques structurelles sont adaptées pour lier spécifiquement le PS et le transférer entre les membranes. Néanmoins, la façon dont ces protéines ont transféré le PS de l’ER au PM n’était pas claire. Osh6p et Osh7p peuvent piéger PI(4)P comme ligand lipidique^{alternatif 12.} Dans la levure, PI(4)P est synthétisé à partir du phosphatidylinositol (PI) dans le Golgi et le PM par les PI 4-kinases, Pik1p et Stt4p, respectivement. En revanche, il n’y a pas de PI(4)P dans la membrane ER, car ce lipide est hydrolysé en PI par la phosphatase Sac1p. Par conséquent, un gradient PI(4)P existe à la fois aux interfaces ER/Golgi et ER/PM. Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM via des cycles d’échange PS/PI(4)P en utilisant le gradient PI(4)P qui existe entre ces deux membranes¹².

Au cours d’un cycle, Osh6p extrait le PS de l’ER, échange le PS contre le PI(4)P au PM et transfère le PI(4)P à l’ER pour extraire une autre molécule de PS. Osh6p / Osh7p interagissent avec Ist2p²⁸, l’une des rares protéines qui se connectent et rapprochent la membrane ER et le PM pour créer des sites de contact ER-PM dans la levure^29,30,31. De plus, l’association d’Osh6p avec des membranes chargées négativement devient faible dès que la protéine extrait l’un de ses ligands lipidiques en raison d’un changement conformationnel qui modifie ses caractéristiques électrostatiques³². Cela aide Osh6p en raccourcissant son temps de séjour membranaire, maintenant ainsi l’efficacité de son activité de transfert lipidique. Combiné à la liaison à Ist2p, ce mécanisme pourrait permettre à Osh6p/7p d’exécuter rapidement et avec précision l’échange de lipides à l’interface ER/PM. Dans les cellules humaines, les protéines ORP5 et ORP8 exécutent l’échange PS/PI(4)P sur les sites de contact ER-PM via des mécanismes distincts³³. Ils ont une ORD centrale, semblable à Osh6p, mais sont directement ancrés à l’ER via un segment transmembranaire C-terminal³³ et s’amarrent au PM via un domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) N-terminal qui reconnaît PI(4)P et PI(4,5)P₂^33,34,35. ORP5/8 utilise PI(4)P pour transférer PS, et il a été démontré que ORP5/8 régule en outre les niveaux de PM PI(4,5)P₂ et module probablement les voies de signalisation. À son tour, une diminution des niveaux de PI(4)P et PI(4,5)P₂ diminue l’activité ORP5/ORP8 car ces protéines s’associent au PM d’une manière dépendante du PIP. La synthèse anormalement élevée de PS, qui conduit au syndrome de Lenz-Majewski, a un impact sur les niveaux de PI(4)P par ORP5/8³⁶. Lorsque l’activité des deux protéines est bloquée, le PS devient moins abondant au PM, ce qui réduit la capacité oncogène des protéines de signalisation³⁷.

Inversement, la surexpression d’ORP5 semble favoriser l’invasion des cellules cancéreuses et les processus métastatiques³⁸. Ainsi, les altérations de l’activité ORP5/8 peuvent modifier gravement le comportement cellulaire par des changements dans l’homéostasie lipidique. De plus, ORP5 et ORP8 occupent les sites de contact ER-mitochondries et préservent certaines fonctions mitochondriales, éventuellement en fournissant PS^39. De plus, ORP5 se localise sur les sites de contact des gouttelettes ER-lipidiques pour délivrer du PS aux gouttelettes lipidiques par échange PS/PI(4)P⁴⁰. La stratégie décrite ici pour mesurer (i) l’extraction de PS et DEP(4)P à partir de liposomes et (ii) le transport de PS et de PI(4)P entre liposomes a été conçue pour établir et analyser l’activité d’échange de PS/PI(4)P d’Osh6p/Osh7p^12,32 et utilisée par d’autres groupes pour analyser l’activité d’ORP5/ORP8³⁵ et d’autres LTP^{10, 41}. Il est basé sur l’utilisation d’un lecteur de plaque de fluorescence, d’un spectrofluoromètre standard au format L et de deux capteurs fluorescents, NBD-C2_Lact et NBD-PH_FAPP,qui peuvent détecter PS et PI(4)P, respectivement.

NBD-C2_Lact correspond au domaine C2 de la glycoprotéine, la lactadhérine, qui a été remanié pour inclure une cystéine unique exposée au solvant près du site de liaison présumé du PS; un fluorophore NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) sensible à la polarité est lié de manière covalente à ce résidu(Figure 1A)^12. Pour être plus précis, le domaine C2 de la lactadhérine (Bos taurus, UniProt: Q95114, résidus 270-427) a été cloné dans un vecteur pGEX-4T3 à exprimer en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) chez Escherichia coli. La séquence C2_Lact a ensuite été mutée pour remplacer deux résidus de cystéine accessibles aux solvants (C270, C427) par des résidus d’alanine et pour introduire un résidu de cystéine dans une région proche du site putatif de liaison PS (mutation H352C) qui peut ensuite être marqué avec N,N’-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylène diamine (IANBD)12 . Un site de clivage de la thrombine est présent entre la protéine GST et le N-terminus du domaine C2. Un avantage majeur est que ce domaine reconnaît sélectivement PS d’une manière indépendante de Ca²⁺contrairement à d’autres domaines C2 connus ou Annexin A5⁴². NBD-PH_FAPP est dérivé du domaine PH de la protéine 1 humaine adapteur de quatre phosphates (FAPP1), qui a été remaniée pour inclure une seule cystéine exposée au solvant qui peut être étiquetée avec un groupe NBD près du site de liaison PI(4)P (Figure 1A)⁴³. La séquence nucléotidique du domaine PH de la protéine FAPP humaine (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) a été clonée en un vecteur pGEX-4T3 pour être exprimé en tandem avec une étiquette GST. La séquence PH_FAPP a été modifiée pour insérer un résidu de cystéine unique dans l’interface de liaison membranaire de la protéine^43. De plus, un agent de liaison à neuf résidus a été introduit entre le site de clivage de la thrombine et la terminaison N du domaine PH pour assurer l’accessibilité à la protéase.

Pour mesurer l’extraction de PS à partir de liposomes, NBD-C2_Lact est mélangé à des liposomes en phosphatidylcholine (PC) contenant des traces de PS. En raison de son affinité pour le PS, cette construction se lie aux liposomes, et le fluorophore NBD subit un changement de polarité lorsqu’il entre en contact avec l’environnement hydrophobe de la membrane, ce qui provoque un décalage bleu et une augmentation de la fluorescence. Si le PS est extrait presque complètement par une quantité stœchiométrique de LTP, la sonde ne s’associe pas aux liposomes, et le signal NBD est plus faible(Figure 1B)³². Cette différence de signal est utilisée pour déterminer si un LTP(par exemple, Osh6p) extrait PS. Une stratégie similaire est utilisée avec NBD-PH_FAPP pour mesurer l’extraction PI(4)P(Figure 1B), comme décrit précédemment^12,32. Deux tests basés sur FRET ont été conçus pour (i) mesurer le transport PS des liposomes L_A à L_B, qui imitent respectivement la membrane ER et le PM, et (ii) le transport PI(4)P dans le sens inverse. Ces essais sont effectués dans les mêmes conditions(c.-à-d. même tampon, température et concentration lipidique) pour mesurer l’échange PS/PI(4)P. Pour mesurer le transport de la PS, NBD-C2_Lact est mélangé à des liposomes L_A composés de PC et dopés avec 5 mol% de PS et 2 mol% d’une phosphatidyléthanolamine fluorescente marquée à la rhodamine (Rhod-PE) – et des liposomes L_B incorporant 5 mol% PI(4)P.

Au temps zéro, FRET avec Rhod-PE éteint la fluorescence NBD. Si le PS est transporté des liposomes L_A vers L_B (par exemple, lors de l’injection d’Osh6p), une décrochage rapide se produit en raison de la translocation des molécules NBD-C2_Lact des liposomes L_A à L_B (Figure 1C). Compte tenu de la quantité de PS accessible, NBD-C2_Lact reste essentiellement dans un état lié à la membrane au cours de l’expérience¹². Ainsi, l’intensité du signal NBD est directement corrélée avec la distribution de NBD-C2_Lact entre les liposomes L_A et L_B et peut être facilement normalisée pour déterminer la quantité de PS transférée. Pour mesurer le transfert de PI(4)P dans la direction opposée, NBD-PH_FAPP est mélangé avec des liposomes L_A et L_B; étant donné qu’il ne se lie qu’aux liposomes L_B qui contiennent pi(4)P, mais pas Rhod-PE, sa fluorescence est élevée. Si PI(4)P est transféré aux liposomes L_A, il se transfère à ces liposomes, et le signal diminue en raison de FRET avec Rhod-PE (Figure 1C). Le signal est normalisé pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée⁴³.

Protocol

1. Purification de NBD-C2Lact REMARQUE: Bien que ce protocole détaille l’utilisation d’un perturbateur cellulaire pour briser les bactéries, il peut être modifié pour utiliser d’autres stratégies de lyse(par exemple, une presse Français). Au début de la purification, il est obligatoire d’utiliser un tampon fraîchement dégazé, filtré et complété par 2 mM de dithiothréitol (DTT) pour éviter l’oxydation de la cystéine. Cependant, pour l’étape de marq…

Representative Results

Figure 1: Description des capteurs lipidiques fluorescents et des essais in vitro. (A) Modèles tridimensionnels de NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP basés sur la structure cristalline du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648) et la structure RMN du domaine PH de la protéine FAP…

Discussion

Les résultats de ces tests reposent directement sur les signaux des capteurs lipidiques fluorescents. Ainsi, la purification de ces sondes marquées à un rapport de 1:1 avec NBD et sans contamination fluorophore NBD libre est une étape critique de ce protocole. Il est également obligatoire de vérifier si le LTP examiné est correctement plié et non agrégé. La quantité de LTP testée dans les essais d’extraction doit être égale ou supérieure à celle des molécules PS ou PI(4)P accessibles pour mesurer corre…

Materials

L-cysteine ≥97 % (FG)	Sigma	W326305-100G	Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3	Wheaton	W224681
4 mm-diameter glass beads	Sigma	Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube	Falcon
ÄKTA purifier	GE healthcare		FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa	Merck	UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampicillin			Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells	Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P	Echelon Lipids	P-4016-3	Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	850375C-500mg
CaCl2	Sigma		Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor	Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C.
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm).	Biorad	7321010
Electroporation cuvette 2 mm	Ozyme	EP102
Electroporator Eppendorf 2510	Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes	Beckman	Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment	Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-05
Glycerol (99% pure)	Sigma	G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column	GE healthcare	GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Euromedex	EU0008-B	Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C.
K-Acetate	Prolabo	26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose			Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen	Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8%	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter.
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding	Greiner Bio-one	655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes	Avanti Polar Lipids	610023
Monochromator-based fluorescence plate reader	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)	Molecular Probes		Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)	Duran Group
Pepstatin	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid			Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid			Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC)	Sigma	P7626-25g	Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon	Sigma	R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm	Avanti Polar Lipids	610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)	Biorad	7311550
Prefilters (10 mm in diameter).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL)	Hellma
Quartz cuvettes	Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R	Eppendorf
Rotary evaporator	Buchi	B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)	Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)	Eppendorf
SYPRO orange			fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer	Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA	Sigma	10602400001	Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure	MP	819623
Ultracentrifuge L90K	Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer	SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device	Jasco or Shimadzu	Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath	Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR	GE healthcare