Флуоресцентные измерения обмена фосфатидилсерина/фосфатидилинозитола 4-фосфата между мембранами

Summary

Здесь мы описываем протоколы с использованием флуоресцентных липидных датчиков и липосом, чтобы определить, извлекает ли белок и транспортирует ли он фосфатидилсерин или фосфатидилинозитол 4-фосфат in vitro.

Abstract

Недавно было обнаружено, что несколько членов семейства гомологов (Ош), связанных с оксистерол-связывающим белком (OSBP) / OSBP (Osh), представляют собой новую группу липидных трансферных белков (LTP) в дрожжах и клетках человека. Они переносят фосфатидилсерин (PS) из эндоплазматического ретикулума (ER) в плазматическую мембрану (PM) через циклы обмена PS/фосфатидилинозитол 4-фосфат (PI(4)P). Это открытие позволяет лучше понять, как PS, который имеет решающее значение для сигнальных процессов, распределяется по всей клетке, и исследование связи между этим процессом и метаболизмом фосфоинозитида (PIP). Разработка новых протоколов на основе флуоресценции сыграла важную роль в открытии и характеристике этого нового клеточного механизма in vitro на молекулярном уровне. В данной работе описывается производство и использование двух флуоресцентно меченых липидных датчиков, NBD-C2_Lact и NBD-PH_FAPP,для измерения способности белка извлекать PS или PI(4)P и переносить эти липиды между искусственными мембранами. Во-первых, протокол описывает, как производить, маркировать и получать образцы высокой чистоты этих двух конструкций. Во-вторых, в этой статье объясняется, как использовать эти датчики с флуоресцентным считывателем микропластин, чтобы определить, может ли белок извлекать PS или PI(4)P из липосом, используя Osh6p в качестве тематического исследования. Наконец, этот протокол показывает, как точно измерить кинетику обмена PS/PI(4)P между липосомами определенного липидного состава и определить скорость переноса липидов путем флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) с использованием стандартного флуорометра.

Introduction

Точное распределение липидов между различными мембранами и внутри мембран эукариотических клеток^1,2 имеет глубокие биологические последствия. Расшифровка того, как функционируют LFP, является важным вопросом в клеточной биологии^3,4,5,6,и подходы in vitro имеют большое значение для решения этой проблемы^7,8,9,10,11. Здесь представлена стратегия in vitro,основанная на флуоресценции, которая сыграла важную роль в установлении того, что несколько белков ОВП/Ош влияют на обмен PS/PI(4)P между клеточными мембранами¹² и тем самым составляют новый класс ЛТП. PS представляет собой анионный глицерофосфолипид, который составляет 2-10% от общего количества мембранных липидов в эукариотических клетках^13,14,16. Он распределяется по градиенту между ER и PM, где составляет 5-7% и до 30% глицерофосфолипидов соответственно^17,18,19. Кроме того, PS по существу концентрируется в цитозольном листке ТЧ. Это накопление и неравномерное разделение PS в PM имеют решающее значение для клеточных сигнальных процессов^19. Благодаря отрицательному заряду молекул PS, цитозольный листок PM гораздо более анионный, чем цитозольный листок других органелл^1,2,19,20. Это позволяет рекрутировать с помощью электростатических сил сигнальные белки, такие как миритоилированный богатый аланином субстрат С-киназы (MARCKS)^21,саркома (Src)^22,вирусный онкоген саркомы Кирстен-крысы (K-Ras)²³и связанный с Ras субстрат ботулинического токсина C3 1 (Rac1)^24, которые содержат участок положительно заряженных аминокислот и липидный хвост.

PS также распознается обычной протеинкиназой C стереоселективным образом через домен C2^25. Однако PS синтезируется в ER^26,что указывает на то, что он должен быть экспортирован в PM, прежде чем он сможет играть свою роль. Не было известно, как это было достигнуто^19, пока не было обнаружено, что в дрожжах Osh6p и Osh7p переносят PS из ER в PM^27. Эти LFP принадлежат к эволюционно сохраненной семье у эукариот, членом-основателем которых является OSBP и который содержит белки (ОВП у человека, Ошские белки в дрожжах), интегрируя связанный с OSBP домен (ORD) с карманом для размещения липидной молекулы. Osh6p и Osh7p состоят только из ОРД, структурные особенности которого адаптированы для специфическиго связывания ПС и переноса его между мембранами. Тем не менее, как эти белки направленно передавали PS из ER в PM, было неясно. Osh6p и Osh7p могут захватывать PI(4)P в качестве альтернативного липидного лиганда^12. В дрожжах PI(4)P синтезируется из фосфатидилинозитала (PI) в Гольджи и PM с помощью PI 4-киназ, Pik1p и Stt4p соответственно. Напротив, в мембране ER нет PI(4)P, так как этот липид гидролизуется в PI фосфатазой Sac1p. Следовательно, градиент PI(4)P существует как на интерфейсах ER/Golgi, так и на интерфейсах ER/PM. Osh6p и Osh7p передают PS из ER в PM через обменные циклы PS/PI(4)P с использованием градиента PI(4)P, который существует между этими двумя мембранами^12.

В течение одного цикла Osh6p извлекает PS из ER, обменивает PS на PI(4)P в PM и передает PI(4)P обратно в ER для извлечения другой молекулы PS. Osh6p / Osh7p взаимодействуют с Ist2p^28, одним из немногих белков, которые соединяют и приводят мембрану ER и PM в непосредственное соседство друг с другом для создания контактных сайтов ER-PM в дрожжах^29,30,31. Кроме того, ассоциация Osh6p с отрицательно заряженными мембранами становится слабой, как только белок извлекает один из своих липидных лигандов из-за конформационного изменения, которое изменяет его электростатические особенности^32. Это помогает Osh6p, сокращая время пребывания мембраны, тем самым поддерживая эффективность его активности переноса липидов. В сочетании с привязкой к Ist2p этот механизм может позволить Osh6p/7p быстро и точно выполнять липидный обмен на интерфейсе ER/PM. В клетках человека белки ORP5 и ORP8 осуществляют обмен PS/PI(4)P в контактных местах ER-PM с помощью различных механизмов^33. Они имеют центральный ORD, похожий на Osh6p, но непосредственно привязаны к ER через C-концевой трансмембранный сегмент³³ и стыкуются с PM через N-концевую область гомологии Плекстрина (PH), которая распознает PI(4)P и PI(4,5)P₂^33,34,35. ORP5/8 используют PI(4)P для передачи PS, и было показано, что ORP5/8 дополнительно регулируют уровни PI(4,5)P_{2 и, предположительно,} модулируют сигнальные пути. В свою очередь, снижение уровней PI(4)P и PI(4,5)P₂ снижает активность ORP5/ORP8, поскольку эти белки связываются с PM в зависимости от PIP. Аномально высокий синтез PS, который приводит к синдрому Ленца-Маевского, влияет на уровни PI(4)P через ORP5/8^36. Когда активность обоих белков блокируется, PS становится менее обильным в PM, снижая онкогенную способность сигнальных белков^37.

И наоборот, сверхэкспрессия ОВП5, по-видимому, способствует инвазии раковых клеток и метастатическим процессам^38. Таким образом, изменения активности ORP5/8 могут серьезно модифицировать клеточное поведение через изменения липидного гомеостаза. Кроме того, ORP5 и ORP8 занимают контактные участки ER-митохондрий и сохраняют некоторые митохондриальные функции, возможно, путем поставки PS^39. Кроме того, ORP5 локализуется в местах контакта ER-липидных капель для доставки PS к липидным каплям путем обмена PS/PI(4)P^40. Описанная в настоящем документе стратегия измерения (i) экстракции PS и PI(4)P из липосом и (ii) переноса PS и PI(4)P между липосомами была разработана для установления и анализа обменной активности PS/PI(4)P Osh6p/Osh7p^12,32 и используется другими группами для анализа активности ORP5/ORP8³⁵ и других ЛТП^{10, 41}г. Он основан на использовании флуоресцентного пластинчатого считывателя, стандартного спектрофлуфультометра L-формата и двух флуоресцентных датчиков, NBD-C2_Lact и NBD-PH_FAPP,которые могут обнаруживать PS и PI(4)P соответственно.

NBD-C2_Lact соответствует домену C2 гликопротеина, лактадхерина, который был реконтруирован, чтобы включить уникальный цистеин, подвергающийся воздействию растворителя, вблизи предполагаемого места связывания PS; чувствительный к полярности ФБД (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол) флуорофор ковалентно связан с этимостатком (рисунок 1А)^12. Чтобы быть более точным, домен C2 лактадерина (Bos taurus, UniProt: Q95114, остатки 270-427) был клонирован в вектор pGEX-4T3 для экспрессии в слиянии с глутатион S-трансферазой (GST) в Escherichia coli. Затем последовательность C2_Lact мутировали, чтобы заменить два доступных растворителями остатка цистеина (C270, C427) остатками аланина и ввести остаток цистеина в область вблизи предполагаемого ps-сайта связывания (мутация H352C), которая впоследствии может быть помечена N,N’-диметил-N-(йодоацетил)-N’-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)этилендиамином (IANBD) ^12. Участок расщепления тромбина присутствует между белком GST и N-концем домена C2. Основным преимуществом является то, что этот домен выборочно распознает PS в Ca²⁺-независимом порядке, в отличие от других известных доменов C2 или Annexin A5⁴². NBD-PH_FAPP получен из домена PH человеческого четырехфосфат-адапторного белка 1 (FAPP1), который был реинжининерирован для включения одного цистеина, подвергающегося воздействию растворителя, который может быть помечен группой NBD вблизи сайта связывания PI(4)P(рисунок 1A)^43. Нуклеотидная последовательность домена PH человеческого белка FAPP (UniProt: Q9HB20, сегмент [1-100]) была клонирована в вектор pGEX-4T3 для экспрессии в тандеме с меткой GST. Последовательность PH_FAPP была модифицирована для вставки уникального остатка цистеина в мембраносвязывающий интерфейс белка^43. Кроме того, между участком расщепления тромбина и N-конечной стороной домена PH был введен линкер с девятью остатками для обеспечения доступности протеазы.

Для измерения экстракции PS из липосом NBD-C2_Lact смешивают с липосомами, состоящими из фосфатидилхолина (PC), содержащими следовые количества PS. Благодаря своему сродству к PS, эта конструкция связывается с липосомами, и флуорофор NBD испытывает изменение полярности при контакте с гидрофобной средой мембраны, что вызывает синий сдвиг и увеличение флуоресценции. Если PS извлекается почти полностью стехиометрическим количеством LTP, зонд не связывается с липосомами, а сигнал NBD ниже(Рисунок 1B)^32. Эта разница в сигнале используется для определения того, извлекает ли LTP(например, Osh6p) PS. Аналогичная стратегия используется с NBD-PH_FAPP для измерения извлечения PI(4)P(рисунок 1B),как описано^{ранее 12,32.} Два анализа на основе ФРЕТ были разработаны для (i) измерения переноса PS от L_A до L_B липосом, которые имитируют мембрану ER и PM, соответственно, и (ii) перенос PI(4)P в обратном направлении. Эти анализы выполняются в одинаковых условиях(т.е. одинаковый буфер, температура и концентрация липидов) для измерения обмена PS/PI(4)P. Для измерения транспорта PS NBD-C2_Lact смешивают с липосомами L_A, состоящими из PC, и легируют 5 моль% PS и 2 моль% флуоресцентного фосфатидилэтаноламина(Rhod-PE)-и L_B липосом, включающих 5 моль% PI(4)P.

В нулевое время FRET с Rhod-PE гасят флуоресценцию NBD. Если PS транспортируется из липосом L_A в L_B (например, при инъекции Osh6p), происходит быстрое закапливание за счет транслокации молекул_лакта NBD-C2 из липосом L_A в L_B (рисунок 1C). Учитывая количество доступного PS, NBD-C2_Lact остается по существу в мембранно-связанном состоянии в течение эксперимента^12. Таким образом, интенсивность сигнала NBD напрямую коррелирует с распределением NBD-C2_Lact между липосомами L_A и L_B и может быть легко нормализована для определения того, сколько PS передается. Для измерения переноса PI(4)P в противоположном направлении NBD-PH_FAPP смешивают с липосомами L_A и L_B; учитывая, что он связывается только с липосомами L_B, которые содержат PI(4)P, но не Rhod-PE, его флуоресценция высока. Если PI(4)P переносится в липосомы L_A, он переносится на эти липосомы, и сигнал уменьшается из-за FRET с Rhod-PE(рисунок 1C). Сигнал нормализуется, чтобы определить, сколько PI(4)P передается^43.

Protocol

1. Очисткалакта NBD-C2 ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол подробно описывает использование разрушителя клеток для разрушения бактерий, он может быть модифицирован для использования других стратегий лизиса(например, французская пресса). В начале очистки в обязательно…

Representative Results

Рисунок 1:Описание флуоресцентных липидных датчиков и анализов in vitro. (A) Трехмерные модели NBD-C2Lact и NBD-PHFAPP на основе кристаллической структуры домена C2 бычих лактадерина (PDB…

Discussion

Результаты этих анализов напрямую зависят от сигналов флуоресцентных липидных датчиков. Таким образом, очистка этих зондов, помеченных в соотношении 1:1 с NBD и без свободного загрязнения флуорофором NBD, является критическим шагом в этом протоколе. Также в обязательном порядке проверяет?…

Materials

L-cysteine ≥97 % (FG)	Sigma	W326305-100G	Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3	Wheaton	W224681
4 mm-diameter glass beads	Sigma	Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube	Falcon
ÄKTA purifier	GE healthcare		FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa	Merck	UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampicillin			Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells	Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P	Echelon Lipids	P-4016-3	Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	850375C-500mg
CaCl2	Sigma		Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor	Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C.
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm).	Biorad	7321010
Electroporation cuvette 2 mm	Ozyme	EP102
Electroporator Eppendorf 2510	Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes	Beckman	Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment	Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads	GE Healthcare	17-0756-05
Glycerol (99% pure)	Sigma	G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column	GE healthcare	GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Euromedex	EU0008-B	Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C.
K-Acetate	Prolabo	26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose			Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen	Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8%	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter.
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding	Greiner Bio-one	655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes	Avanti Polar Lipids	610023
Monochromator-based fluorescence plate reader	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)	Molecular Probes		Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)	Duran Group
Pepstatin	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid			Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid			Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC)	Sigma	P7626-25g	Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon	Sigma	R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm	Avanti Polar Lipids	610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)	Biorad	7311550
Prefilters (10 mm in diameter).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL)	Hellma
Quartz cuvettes	Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R	Eppendorf
Rotary evaporator	Buchi	B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)	Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)	Eppendorf
SYPRO orange			fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer	Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA	Sigma	10602400001	Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure	MP	819623
Ultracentrifuge L90K	Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer	SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device	Jasco or Shimadzu	Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath	Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR	GE healthcare